鹼性磷酸酶（ALP）特性及測定方法（提供檢測試劑盒）

鹼性磷酸酶又稱鹼性磷酸酯酶，al

kaline phosphatase，

又稱正磷酸單酯磷酸水解酶，簡稱

ALP 或 AKP或

AP，

現多用ALP；

最適pH為鹼性，E。C。3。1。3。1。鹼性磷酸酶廣泛分佈於人體肝臟、骨骼、腸、腎和胎盤等組織經肝臟向膽外排出的一種酶。這種酶能催化核酸分子脫掉5’磷酸基團，從而使DNA或RNA片段的5’-P末端轉換成5’-OH末端。但它不是單一的酶，而是一組同工酶 。已發現有AKP1、AKP2、AKP3、AKP4、AKP5與AKP6六種同功酶。其中第1、2、6種均來自肝臟，第3種來自骨細胞，第4種產生於胎盤及癌細胞，而第5種則來自小腸絨毛上皮與成纖維細胞。

臨床上測定ALP主要用於骨骼、肝膽系統疾病的診斷和鑑別診斷，尤其是黃疸的鑑別診斷。對於不明原因的高ALP血清水平，可測定同工酶以協助明確其器官來源。

一、概況

1。反應式

最適pH值為8~10，隨著所用的底物與各種酶源而變化。

2。米氏常數

3。專一性

此酶能催化水解磷酸單酯、磷酸核苷以及6-磷酸糖之類，然而，卻不能水解磷酸二酯類。尚能水解焦磷酸酯及以下磷酸酯類：伯醇、仲醇、糖醇、環化醇、酚以及胺之類的磷酸酯。

4。啟用劑與抑制劑

Mg2+與Mn2+離子為啟用劑，Mg2+最適濃度為10-3克分子濃度。抑制劑有磷酸鹽、Zn2+、Be2+、AsO4-、CN-、草酸鹽以及巰基化合物等。此酶對甘氨酸緩衝液表現的活性較低，這可能是由於與Mg2+離子結合的緣故。L-苯丙氨酸、L-半胱氨酸以及L色氨酸亦具有抑制作用。

5。純度要求

所需要的純度至少為每毫克蛋白含 25單位活性。

6。意義

體內各組織皆有此酶，尤其在肝臟、胎盤、白血細胞和腎小管等器官組織中含此酶量較高。血清中此酶是由肝臟產生的。

患有佩吉特（Paget）氏病時，血清中鹼性磷酸酯酶水平很高；患梗阻性黃疸時，此酶水平由中等程度上升至高水平；患佝僂病時，此酶水平升高2~4倍。

7。 穩定性

血清鹼性磷酸酯酶在 25℃下尚能保持穩定。

二、測定方法

1。分光光度法

曾提出幾種底物，用來對酸性磷酸酯酶與鹼性磷酸酯酶進行比色測定。酚酞二磷酯即能被磷酸酯酶水解為酚酞，於是，可用比色法在530nm處加以測定。首先，必須使酚酞中二個磷酸根分解，然後，方能使酚酞於鹼性條件下呈現顏色。

因此，酚酞單磷酸酯被認為是磷酸酯酶的較好底物。與此類似，使用百里酚酞單磷酸酯作為底物。某些作者提出以對-硝基酚磷酸酯作為底物，在405nm處測量生成的對-硝基酚的速度。該速度與磷酸酯酶活性成正比。有人建議採用磷酸苯酚酯作為底物測量牛奶中的磷酸酯酶，經2小時保溫之後，釋放出的苯酚可用2，6-二溴苯醌-4-氯亞胺在600nm處進行比色測定。

同樣，曾提出使用苯酚磷酸酯作為底物，使用Folin-Ciolcalteu試劑測量所生成的苯酚，跟蹤反應速度。此反應需保溫30分鐘，並且須將樣品進行脫蛋白。

另一種檢測方法，在鹼性環境中，鹼性磷酸酶AKP/ALP催化磷酸苯二鈉生成遊離酚；酚與4-氨基安替比林和鐵氰化鉀反應紅色亞醌衍生物，在510nm有特徵光吸收；透過測定510nm吸光度增加速率，來計算AKP活性。

2。熒光法

由於熒光法有較高的靈敏度，所以，有幾種分析方法已採用經酶水解後能產生熒光的底物。製備磷酸萘酚酯作為酸性與鹼性磷酸酯酶的底物，記錄生成熒光的a-萘酚（即磷酸酯酶加到a-萘酚磷酸酯後釋放出來的）的速度，然後，從初速度與磷酸酯酶的濃度所作的校正曲線上即可計算出酶量。按類似Moss氏方法，使用了一種β-萘酚磷酸酯的鈉鹽作為鹼性磷酸酯酶的底物，曾使用此底物測定酸性磷酸酯酶。使用核黃素-5-磷酸酯為底物，將它用於組織化學方法中，以測量組織中磷酸酯酶的活性。一種薄膜標記技術，使用β-萘酚磷酸酯或3-O-甲基熒光素磷酸酯作為底物，以此測量磷酸酯酶同工酶。

有文獻發現黃酮-3-二磷酸酯對於測定酸性與鹼性磷酸酯酶是一種穩定、多效與靈敏的底物。對於3-羥基黃酮的熒光度可在510nm處加以測定。他們還發現該底物比β-萘酚磷酸酯更為靈敏，並較之3-O-甲基熒光素磷酸酯穩定。至於較高的靈敏度，人們認為是由於3-羥基黃酮與鋁離子生成有熒光的金屬整合物所致。

有文獻利用4-甲基傘形酮磷酸酯作為小牛腸的鹼性磷酸酯酶的底物，並測量了反應動力學與熱力學常數。

有文獻製備了傘形酮磷酸酯作為酸性與鹼性磷酸酯酶的底物，並將該底物同文獻資料中介紹的其它底物作比較，結果總結在下面2個表中，其中有兩種比色底物不太靈敏，即水解速度低，且需大量樣品。當採用萘酚的磷酸酯與乙酸酯時，將使其某些效能有所改善。這些底物的水解產物，即 a-與β-萘酚的熒光度卻不是特別強的。但和比色底物比較，其靈敏度仍有所增加，但增加不大。在測定磷酸酯酶所要求的pH條件下，由於其自發水解速度過高而使它成為一個不適用的底物。

就穩定性方面而論，酶促水解速度與形成產物的熒光度，傘形酮磷酸酯（XI）仍是一種理想的底物。所形成的傘形酮（XII）具有比萘酚、吲羥、3-羥基黃酮以及4-甲基傘形酮更高的熒光度。 除了3羥基黃酮磷酸酯外，較其它所有底物都要好。使用傘形酮磷酸酯，對僅僅10-6單位的鹼性磷酸酯酶與10-5單位的酸性磷酸酯酶都能被檢出，並且用直接初速度法即可在2~3 分鐘內測定。可測定濃度範圍為每毫升10-6~2x10-2單位的鹼性磷酸酯酶與每毫升10-5~0。06單位的酸性磷酸酯酶，其精確度約為1。5%。

有文獻介紹了以溶液與矽橡膠墊二種方式測定血清中鹼性磷酸酯酶與酸性磷酸酯酶的熒光法。所用的底物為4-甲基傘形酮磷酸酯，然後，測定4-甲基傘形酮所產生的熒光度的速度，對於酸性磷酸酯酶的最適pH為6。2，其測定的激發波長為326nm，對於鹼性磷酸酯酶的最適pH為8其測定的激發波長為365nm，兩者所用的發射波長皆為447 毫微米。所需樣品僅20微升。當血清中鹼性磷酸酯酶與酸性磷酸酯酶的濃度範圍分別為30~635單位/升，與0。265~5。3King Armstrong單位/升時，由此測得的比值甚佳。例如，以溶液測定法測得的變異係數為2。2%，而以非溶液試劑的半固體表面測定法測得的變異係數僅為1。4%。

表1 適用於酸性磷酸酶的各種底物之比較

①自發水解速度，以每分鐘所產生的吸光率差值或熒光度單位差值表示。

②

0。03毫克/毫升的Ⅱ型酸性磷酸酯酶的速度，以吸光率差值/分鐘或熒光度差值/分鐘表示。

③=-Tris鹽。

表2-3 適用於牛肝鹼性磷酸酶的各種底物的熒光係數與米氏常數

①由水解底物的熒光度除以原始濃度（M）。在激發波長350毫微米與發射波長450毫微米處時，硫酸奎寧溶解於0。1N的硫酸溶液中測得的數值為1。75 x106/克分子。

有文獻研究了一系列作為酸性與鹼性磷酸酯酶的底物，即3-羥基-2-萘醯替苯胺（萘酚 AS衍生物）酯類的熒光特性。最佳的底物為萘酚AS-BI磷酸酯，它已被用於固定在矽橡膠墊片表面，作為對鹼性磷酸酯酶以非溶液試劑方法的測定。這種底物的產物優點是具有一種亮綠熒光分子（激發波長=405m，發射波長=515m）。各種底物效能之比較已列舉在表3中。

3。電化法

建議採用恆電流庫侖法測定酸性與鹼性磷酸酯酶。經酶促水解苯酚磷酸酯而釋放的苯酚，可按電解生成的Br2進行滴定，採用雙電流測定法檢測反應體系的終點，其測定中外加的電壓為135毫伏。所用的電解質溶液為0。5MKBr（含0。05MH2SO），於pH1下進行滴定。上述測定步驟中，測定血清鹼性磷酸酯酶活性時，須加入2-氨基-2-甲基-1-丙醇（0。2%克分子/升，pH10。25）與Mg2+離子（1毫克分子/升）作啟用劑而測定血清中酸性磷酸酯酶活性時，卻使用檸檬酸緩衝液（0。1克分子/升，pH4。9）。可將這些測定結果同其它方法所測得的結果加以比較。

表3 萘酚AS磷酸酯作為酸性與鹼性磷酸酯酶的底物