乙醯膽鹼酯酶（AChE）與丁醯膽鹼酯酶（ChE）特性及應用（試劑盒）

膽鹼酯酶（cholinesterase）是一類糖蛋白，以多種同工酶形式存在於體內。一般可分為真性膽鹼酯酶和假性膽鹼脂酶。真性膽鹼酯酶也稱乙醯膽鹼酯酶，主要存在於膽鹼能神經末梢突觸間隙，特別是運動神經終板突觸後膜的皺摺中聚集較多；也存在於膽鹼能神經元內和紅細胞中。此酶對於生理濃度的Ach作用最強，特異性也較高。一個酶分子可水解3×10分子Ach，一般常簡稱為膽鹼酯酶。假性膽鹼酯酶廣泛存在於神經膠質細胞、血漿、肝、腎、腸中。對Ach的特異性較低，假性膽鹼酯酶可水解其他膽鹼酯類，如琥珀膽鹼。

乙醯膽鹼酯酶和丁醯膽鹼酯酶均為膽鹼酯酶。乙醯膽鹼酯酶又稱乙醯膽鹼羥化酶，真性膽鹼酯酶，AChE， EC。3。1。1。7。丁醯膽鹼酯酶又稱乙醯膽鹼乙醯羥化酶n假性膽鹼酯酶，ChE，E。C。3。1。1。8。

（一）概況

1。反應式

曾觀察到有兩種專一性乙醯膽鹼酯酶，可根據它們各自最適 pH（分別為pH7。2與pH86~8。8）加以區分。

假性膽鹼酯酶（ChE）能催化此反應：

業已發現11種不同的非專一性酯酶，其最適pH值變化範圍為7。2至9。0之間［75］，由此可分出一種丁醯膽鹼酯酶（E。C。 3。1。1。8）。

此酶以前分類稱為苯醯膽鹼酶，但是根據1972年國際酶學委員會推薦的命名法，已將這種命名取消了，因為此酶具有同了醯膽鹼酯酶相似的活性。

2。米氏常數

3。專一性

乙醯膽鹼並非是乙醯膽鹼酯酶的專一性底物，然而，業已證明乙醯-β-甲基膽鹼則是紅血細胞來源的乙醯膽鹼酯酶的專一性底物。此酶對於丙醯或丁醯膽鹼表現活性較低。

苯醯膽鹼與丁醯膽鹼皆為假性膽鹼酯酶的專一性底物。此酶亦能水解甘油三丁酸酯，a-萘醯丁酯以及其它酯類。

4。抑制劑

有機磷化合物既能抑制乙醯膽鹼酯酶（AChE），也能抑制膽鹼酯酶，然而，對於熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）來源的膽鹼酯酶卻例外。但是氨基甲酸酯與季銨鹽類化合物皆能抑制。

5。意義

乙醯膽鹼酯酶主要存在於腦、神經細胞和肌肉等組織中。鑑於下列兩個理由，則可說明乙醯膽鹼酯酶與膽鹼酯酶測定的重要性：（1）種病腫瘤、氣哮喘病和結核病等疾病皆具有診斷價值；（2）能檢測出有機磷殺蟲劑的含量和能指出接觸這類殺蟲劑的工作人員所受的傷害程度。

根據氟化物與奴白卡因（dibuchane的作用而分別給以“FN”與“DN”兩種值，以往通常用來指示兩種不同型別的膽鹼酯酶。當接觸丁二醯膽鹼的作用之後，產生麻醉併發症情況下（即使窒息時間延長），就可能觀察到這兩種型別的膽鹼酯酶。DN與FN的定義可用下式表示：

式中抑制反應速度即表示經奴白卡因（DN）或氟化物（FN）作用後的膽鹼酯酶剩餘活性。

6。穩定性

冷凍乾粉保存於-20℃下，則可穩定6~12個月或更長時間，將酶溶液於4℃儲存僅能穩定幾天時間。

二、測定方法

1。測壓法與pH法

有關測定膽鹼酯酶的經典方法有：測定乙醯膽鹼（Ⅲ）在水解過程中所產生的酸，既可用測壓法測量所釋放的二氧化碳氣體，也可用電位法進行滴定。無論採用那一種方法，一個活性單位總是表示每分鐘內水解一個微克分子的乙醯膽鹼量。在測壓法中，被水解的乙醯膽鹼量可用瓦勃氏儀測量，即由酶促生成的酸，能使碳酸氫鹽-二氧化碳緩衝液中逸出相當量的二氧化碳氣體。在電位法中，可採用一種恆pH滴定法或帶有外用電極的普通pH計來檢測所產生的酸量。恆pH滴定法或Michel法，即是記錄以維持恆定pH所需加入的鹼量，由此加入鹼的速度則為酶促水解速度的計量。

2。比色法

膽鹼酯酶可用靛酚乙酸酯作底物進行比色法測量。產生藍色靛酚的速度就是膽鹼酯酶活性的量度。

這種底物同其它生色底物一樣，它已被用來製備血清膽鹼酯酶的半定量分析試紙。

另一種測定膽鹼酯酶活性的比色法，是依據與未水解的乙醯膽鹼（Ⅲ）底物生成一種棕色的異羥肟酸鐵的絡合物（Ⅱ）的原理。

還有一種簡便的測定膽鹼酯酶活性的比色法。它是由膽鹼酯酶水解乙醯膽鹼的硫醇同類物（V）而產生硫醇，進而與雙-二硫代硝基苯甲酸（BDTNB）起反應，即生成一種深黃色的絡合物，可於412nm處檢測。

此方法發展為臨床化驗室自動化常規分析。這種自動化分析儀，每小時能測定40個樣品。

乙醯膽鹼酯酶常用檢測方法為乙醯膽鹼酯酶AchE 催化乙醯膽鹼水解生成膽鹼，膽鹼與二硫對硝基苯甲酸（DTNB）作用生成 5-巰基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB 在 412nm 處有吸收峰，透過測定 412nm吸光度增加速率，計算乙醯膽鹼酯酶AchE 活性。

3。電化法

根據膽鹼酯酶水解碘化乙醯硫代膽鹼（V）的原理，採取一種電化學法測定膽鹼酯酶。此方法是：將一個 25微安的恆微電流輸入到兩個管狀鉑電極中，記錄酶促水解過程中電壓隨時間的變化值。開始，由於底物135伏的碘化物被氧化成碘而呈現一穩定電壓［97］，當 270千歐2兆歐加入膽鹼酯酶時，由於生成電化性更活潑的硫 明亮的管狀鉑電極飽和甘汞電極醇（V）而使電壓下降。 底物、緩衝劑、酶一可用高阻抗真空管伏特 高阻抗伏特計計測量電壓的變化值。

所測極化曲線的斜記錄儀率，即為膽鹼酯酶水解硫代膽酯的速率。這些速率與用Michaelis Menten動力學公式推算所得的速率頗相一致。按此方法，可測定0。2至14 單位的膽鹼酯酶活性，其標準誤差為0。7%。

4。 熒光法

由於克分子吸光係數、測量氣體體積或pH變化的限制，因而使大部分測量膽鹼酯酶活性的方法，僅限於底物濃度大於10-5M與酶濃度大於10-2單位。生熒底物一般比生色底物要靈敏幾個數量級。因此，倘若採用熒光酯類化合物，則將使酶法測定的靈敏度大為提高。這些化合物本身並無熒光，而是被酶水解後生成易於測量的熒光性產物。所產生的熒光度，可用動力學法進行跟蹤，並據此換算為酶的活性。

四種適用於測量膽鹼酯酶的生熒底物：試滷靈丁酸酯，吲羥乙酸酯和a-與B-萘酚乙酸酯。試滷靈酯是無熒光的，水解後則產生具有強烈熒光的試滷靈（V）。吲羥乙酸酯亦是無熒光的，但被膽鹼酯酶水解時，首先變為吲羥（Ⅶ），而後生成靛白（VIII），兩者皆有強烈的熒光（激發波長=395nm，發射波長=470nm）。當pH值小於7時，生成強烈熒光的靛白，則可長時間穩定而不被空氣氧化成靛藍（IX）。當pH更為鹼性時，溶液的熒光度隨著時間而迅速下降。吲羥和靛白皆具有相同的熒光激發波長和發射波長。靛白的熒光度為吲羥的兩倍。

無論用試滷靈丁酸酯，還是用吲羥乙酸酯作底物，對於每毫升含0。0003至0。12單位的膽鹼酯酶均可在2~3分鐘內測定，其準確度與精密度約為1%。

a-與B-萘酚乙酸酯與丁酸酯均能被膽鹼酯酶水解為a-萘酚（激發波長=330nm；發射波長=460至470nm）與B-萘酚（激發波長=320nm；發射波長=410nm）。一般對於膽鹼酯酶的測定，萘酚酯類不如吲羥乙酸酯或試滷靈丁酸酯那樣靈敏，但每毫升只含0。0005單位的酶也能被檢測出來，其準確度約為3%。

5。放射測量法

根據放射測量法的原理，發展了一種測定膽鹼酯酶的靈敏方法。測量乙醯膽鹼酯酶的方法，是採用乙醯-1-14C膽鹼作為底物，而用計數器測量所釋放的乙酸-1-1C濃度。解物先離子交換法除去，而後將放射性乙酸進行計數測量。所有測定可在30分鐘內完成，其準確度為3%，或更高些。