微生物多樣性+轉錄組測序開發了一種可預防齲齒的新型抗菌肽

前言

齲齒（蛀牙）是最普遍的口腔疾病，嚴重危害人類公共健康，治療費用昂貴。齲齒是細菌生物膜引起的常見疾病。目前臨床防治藥物往往會對口腔微生物多樣性和正常組織產生不良影響，主要原因是藥物的生物膜靶向性較差。因此，開發高效破壞致齲細菌生物膜的抗菌劑對齲齒的防治尤為迫切和重要。

近日，湖南師範大學工程實驗室

張鵬博士後

、

劉中華教授

和南開大學

餘志林研究員

為共同通訊作者，在

期刊（IF：11。556）發表了題為

“Dual-sensitive antibacterial peptide nanoparticles prevent dental caries”

的研究論文，報道了一種pH和脂質雙敏感性抗菌肽奈米粒子pHly-1 NPs用於齲齒的防治。

研究結果

1、 pHly-1依賴於pH和脂質進行構象轉變

首先透過氨基酸替換策略，選擇性的引入組氨酸作為pH敏感元件、調整多肽的電荷以及疏水性，設計pHly-1肽，隨後對pHly-1的電位、形態和二級結構進行了表徵。在正常生理條件下，pHly-1採用β-摺疊構象。在酸性環境下，pHly-1呈無規則捲曲構象，當與脂質雙分子層結合時，pHly-1肽的構象由無規則捲曲構象變換為α-螺旋。多肽的TEM形貌表明，在酸性條件下多肽為大小約40 nm的球形顆粒，而在中性條件下則為長度約400 nm的纖維。

圖1｜pHly-1設計及其pH或脂質響應構象

2、pHly-1顯示pH和脂質雙敏感的抗菌活性

變形鏈球菌UA159（）的最低抑制濃度（MICs）檢測和溶血實驗測定結果顯示，pHly-1 NPs抗菌活性高，且溶血活性小（圖2A-B）。在pH 5。5和7。0時，pHly-1 NPs 的MIC值分別為5。5 μM和大於44 μM。殺菌動力學表明，pHly-1 NPs殺菌迅速，且具有pH依賴性，效果優於CHX（口服抗菌治療金標準）（圖2C-D）。

表明了pHly-1是一種pH敏感的抗菌肽，在酸性條件下具有強而快速的殺菌活性。其發揮雙敏感的潛在機制如圖2E所示：在酸性pH環境下，當pHly-1與細菌膜表面結合時，構象由無規則捲曲轉變為α-螺旋，導致膜破壞從而表現出較強的抗菌活性。相反，在中性環境下，pHly-1呈β-摺疊構象，彼此間透過多種弱相互作用力而發生堆積，限制了多肽對細菌細胞膜的作用，因此抗菌活性較低。

圖2｜pHly-1抗菌活性的機制

3、pHly-1 NPs抗菌活性的機理分析

直接破壞細菌膜是大多數抗菌肽殺滅細菌最常見的機制。該研究，透過SEM細菌形態觀察和熒光雙染研究，證實pHly-1 NPs在pH4。5酸性條件下具有破壞細菌膜的作用，表現出殺菌作用（圖3A-B）。

轉錄組學

資料進一步顯示，pHly-1 NPs處理後，引起195個基因差異表達（DEGs）。功能富集分析顯示，主要涉及蛋白質摺疊、細胞程式性死亡、細胞溶解、轉錄調控等與在細菌的生存和生長相關條目（圖3C）。

此外，pHly-1 NPs處理導致了細胞溶解調控基因的表達增加，糖代謝、核酸代謝和DNA複製的基因表達降低（圖3D）。除了破壞細菌膜外，與抗菌活性和群體感應相關基因表達下調，群體感應相關基因基因與細菌生物膜發育過程中細菌增殖和群體行為調節有關（圖3D）。該結果也為解釋了pHly-1 NPs抑制細菌生物膜形成和發展奠定了一定基礎。

圖3｜不同pH條件下，pHly-1 NPs或CHX處理細菌後的顯微研究、熒光染色和轉錄組分析

4、pHly-1 NPs體外抑制生物膜的形成和發展

該研究首先測定了pHly-1 NPs對細菌粘附的影響，實驗表明其能抑制了生物膜形成初期的細菌附著。為了進一步評估pHly-1 NPs對預形成生物膜發展的抑制效果，首先讓在載玻片上逐漸形成生物膜，12小時後，用55 μM pHly-1 NPs或CHX，在不同的pH下，處理生物膜10 min，每天一次共計處理3次。隨後採用SEM和共聚焦顯微鏡對生物膜進行成像，圖A中藍色箭頭以及圖B中的綠色熒光代表著，而紅色箭頭以及紅色熒光則代表著形成的EPS基質。

實驗表明在pH 4。5下，pHly-1 NPs處理組中的生物膜團簇、細菌數量和EPS基質密度顯著低於對照組（圖4A-B）。然而，在對照組、pH 7 條件下的pHly-1 NPs和CHX處理組之間沒有觀察到顯著變化（圖4A-B）。以上資料表明，pHly-1 NPs可能以pH依賴性的方式抑制生物膜的形成和發展。

圖4｜體外酸性條件下pHly-1 NPs對細菌生物膜形成和發展的抑制作用

5、pHly-1 NPs體內和體外的齲齒抑制作用

基於唾液包被的羥基磷灰石（sHA）的生物膜形成實驗，作者首先觀察到，pHly-1 NPs處理顯著減少了sHA表面細菌生物膜的數量和大小，將形成的生物膜超聲、勻漿，利用CFU計數法統計各處理組細菌的活力，表明pHly-1 NPs和CHX均能顯著抑制生物膜的形成與發展（圖5A-B）。

隨後收集患有嚴重齲齒兒童的牙菌斑生物膜樣本，分離變形鏈球菌，建立生物膜模型，進一步測試pHly-1 NPs對齲齒生物膜的抑制效果。實驗表明在pHly-1 NPs處理組中對形成的細菌生物膜網路具有顯著的抑制作用（圖5C-D）。上述實驗表明了在酸性條件下，pHly-1 NPs顯著抑制了體外生物膜的形成與發展。

圖5｜pHly-1 NPs體外的齲齒抑制作用

作者基於變形鏈球菌感染幼鼠牙齒的大鼠模型的體外實驗，發現pHly-1 NPs治療對初始、中度和重度病變的均能有效緩解。但CHX治療僅緩解嚴重的病變，對於初始和中度病變的治療效果顯著低於pHly-1 NPs，說明pHly-1 NPs的治療效果優於CHX，並且對大鼠具有良好的生物安全性（圖6）。同時，細胞和類器官等毒性實驗也證實了，pHly-1 NPs對胃組織毒性較低，有效預防已報道的齲齒防治奈米顆粒對胃組織造成的潛在損傷。

圖6｜pHly-1NPs體內的齲齒抑制作用

6、pHly-1 NPs對口腔菌群及周圍組織的不良影響分析

為了評估pHly-1 NPs和CHX應用於漱口水的臨床安全性，將0。2 %的pHly-1 NPs或CHX處理後的小鼠唾液進行微生物組分析。pHly-1 NPs對門水平和屬水平的菌群組成並無影響（圖7A-C），與對照組結果更為相似（圖7D），且不改變口腔微生物的多樣性（圖7E-F），表明pHly-1 NPs沒有破壞微生物群的生態平衡。此外，H&E染色顯示pHly-1 NPs對小鼠牙齦、顎和胃組織沒有明顯的有害影響（圖7G），不良反應僅發生在CHX治療組。

圖7｜pHly-1NPs對口腔菌群及周圍組織的不良影響分析

研究結論

本文研發了pH和脂質雙敏感的抗菌肽pHly-1，在酸性致齲生物膜微環境中，pHly-1與細菌膜結合後發生螺旋構象轉變，從而殺死致齲細菌。pHly-1治療效果優於臨床用藥CHX，對齲齒的預防和治療具備有效、安全的效能。這種肽設計策略為提高抗菌肽的生物相容性和應用於抗菌藥物開發提供了新的途徑。

湖南師範大學張鵬博士後、吳賽芝、李瑾婷以及長沙市口腔醫院卜曉霜為論文的共同第一作者。該研究還得到了梁宋平教授與本校化工院曾佑林教授的大力支援。

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