真核基因轉錄延伸複合體穿過核小體的分子機制

撰文｜望夜

在真核細胞核內，基因組DNA形成高度有序的緻密結構，稱為染色質（chromatin）。染色質的基本單位是核小體（nucleosome），由147bp DNA纏繞組蛋白八聚體形成，其中包含4種組蛋白（H2A、H2B、H3、H4）各兩個複製。核小體帶有多種遺傳和表觀資訊，決定染色質的結構和狀態，對細胞生長、胚胎髮育、癌症發生相關調節基因的轉錄模式起決定作用。基因的轉錄過程影響染色質結構和表觀資訊，因為RNA聚合酶（RNAP）經過核小體時必須先將其解聚，方能轉錄其DNA的序列資訊，但轉錄的同時又必須維持核小體的存在。因此，應當存在一種轉錄偶聯機制，可在聚合酶通過後再組裝並保持核小體結構。

RNAPII在轉錄過程中與多種蛋白因子互作，如轉錄延伸因子、組蛋白伴侶等，共同促進轉錄在染色質上延伸。

FACT

就是一種組蛋白伴侶，包含2個亞基（在酵母中是Spt16和Pob3，在人中是Spt16和SSRP1）。在染色質的轉錄區域，FACT結合核小體，透過介導下游核小體的解聚及其在上游的再組裝，促進RANPII透過核小體

【1】

。在上述過程中，多種轉錄延伸因子參與結合RNAPII。其中，Spt6可強化PNAPII加工，並作為結合PNAPII的組蛋白伴侶參與維持核小體結構

【2】

。其他延伸因子，如Spn1、Spt4/5、Elf1、Paf1複合體（Paf1C，包含Ctr9、Paf1、Leo1、Cdc73、Rtf1亞基）、TFIIS，分別與Spt6和/或FACT互作，參與染色質轉錄並維持其完整性

【3】

。但

轉錄過程中RNA聚合酶II（RNAPII）透過核小體的精確分子機制尚未獲闡述。

近日，日本RIKEN中心的

Hitoshi Kurumizaka

和

Shun-ichi Sekine

研究組

利用冷凍電鏡解析出RNAPII

延伸複合體

（

EC

）透過核小體的多個結構，捕獲到EC在DNA上前進的細節，發現EC可介導下游核小體解聚並在上游重新組裝，組蛋白伴侶FACT促進該過程。

FACT動態地適應持續出現的

亞核小體

（subnucleosome）中間體，並與EC形成一個互作介面。在EC的DNA出口，延伸因子Spt6、Spt4/5、Paf1C形成一個“搖籃”，支援上游核小體的再組裝。上述研究結果以

Structural basis of nucleosome disassembly and reassembly by RNAPII elongation complex with FACT

為題成文，已在

Science

雜誌發表。

在本文中，轉錄是由畢赤酵母（Komagataella pastoris）RNAPII執行的。作者設計出3種核小體DNA模板以使RNAP停留在第42、49、58、115位，分別對應EC前導邊緣靠近核小體的超螺旋位點（SHL）-1、0、+1、+6位。轉錄機器包含延伸因子Spt6、Spn1、Spt4/5、Elf1、Paf1C、TFIIS，及組蛋白伴侶FACT。作者首先確認EC可停留於上述設計位點，隨後使用冷凍電鏡收集複合物資料，共解析獲得6種EC-核小體結構，分別稱為EC42、EC49、EC49B、EC58hex、EC58oct、EC115

（圖1）

。

圖1 6種EC-核小體整體結構

（其中灰色為PNAP，橙色為DNA、DNA中包裹的是組蛋白）

整體結構中，Spt6、Spn1、Spt4/5、Elf1、Paf1C幾乎覆蓋RNAPII整個表面，形成一個大型分子工廠

（圖2A）

。Spn1、Elf1及Paf1C的一部分包圍下游DNA，形成EC下游邊緣；Spt4、Spt5、Spf6及Paf1C另一部分包圍上游DNA，形成EC上游邊緣；Elf1和Spt5的NGN結構域封住RNAPII的主通道。上述互作形成一個長約40bp的通道，握住轉錄泡及上下游DNA的一部分。Spt6和Spt5的KOW4、KOW5結構域結合於RNA出口通道，包裹著長約8nt的出口RNA。Paf1C覆蓋RNAPII的剩餘表面，僅留下次級通道的頂端供TFIIS結合。

EC結構包含幾個獨有特徵：Spn1位於RNAPII夾子的頂點，與Spt6的N端螺旋、Spt5的NGN和KOW2結構域互作

（圖2 B-C）

；Paf1C的β-桶結構域與TFIIF同源結構域的結合位點有重疊；Leo1亞基的C末端延伸形成一個α螺旋，與上游DNA的大溝互作

（圖2D）

；Cdc73亞基的Ras樣結構域位於RNAPII莖的根部，與Spt6的tSH2結構域結合

（圖2E）

；Rtf1亞基的C端部分形成α螺旋結合於Ctr9亞基。

圖2 EC-核小體複合物的整體結構及相對位置細節

本文獲得的前3種EC-核小體結構（EC42、EC49、EC49B）呈現出下游核小體解聚的分子細節。我們一一來看：

在EC42中，前導邊緣靠近下游核小體的SHL（-1）位，此時核小體中約60bp的DNA已經從組蛋白上剝離開，使得靠近轉錄起始點的（以下稱“近端”）H2A-H2B和H3-H4的DNA結合面暴露。Spn1、Spt6、Elf1及Paf1C與RNAPII一起形成下游邊緣，朝向部分開啟的核小體。此時的核小體取向類似此前報道的結構

【4】

，但DNA在SHL（-1）位處解開得略充分些，從而失去與H3 α2螺旋的互作。Spn1和Spt6的N螺旋插入RNAPII與組蛋白之間，Spn1核心結構域與暴露的近端H3-H4直接互作。Spn1和Spt6延伸出的可變尾部密度不可見，但應仍與組蛋白與下游DNA互作。在此狀態中，FACT僅透過其Spt16亞基的C端結構域（CTD）結合暴露的H2A-H2B。

在EC49中，EC的前導邊緣前進至下游核小體的SHL（0）位，即二分位（dyad）。此時，約70bp的DNA已從組蛋白上剝開，致使與近端H3-H4的大部分互作消失。此外，在遠端核小體上也有一段約30bp的DNA片段開啟，使得遠端H2A-H2B的DNA結合面部分暴露。因此，此時組蛋白僅結合約55bp的DNA片段。遠端DNA的解聚源於EC結合產生的空間位阻，故近端DNA的開啟會減弱遠端DNA結合組蛋白的穩定性。

在此狀態下，FACT主體密度清晰可見，結合於已開啟的核小體上。Spt16亞基的中部結構域（MD）與H3-H4四聚體及近端H2A-H2B互作，其中組蛋白部分割槽段的密度被替換為Spt16 MD的中部區密度。Spt16與H3形成若干疏水相互作用，高度酸化的HA1-螺旋及側翼loop結合H3-H4暴露的鹼性表面。此外，Spt16還重建出一個額外的α螺旋，其頂端的R484殘基可與H2A E61、H2B E105互作。Spt16 CTD尾部也與近端H2A-H2B暴露面互作，因此Spt16破壞H2A-H2B與H3-H4間的互作，但穩定了亞核小體結構。

透過比較已發表結構

【5】

，作者認為，只有當EC到達SHL （0） 位並使近一半DNA從組蛋白上解開時，FACT Spt16才完全結合核小體。FACT的另一個亞基Pob3位於核小體背面，其MD與SHL （+1） 位附近的核小體DNA互作。Pob3的二聚化結構域（DD）與Spt16的DD形成一個結構域二聚體（FACT DD），位於SHL（0。5）附近的核小體DNA上。

在EC49B中，EC位置不變，但核小體向下遊移動約17bp，此時EC與FACT-核小體遠遠分開。核小體中的組蛋白再次被DNA纏繞，導致Spt16 MD離開組蛋白，但其CTD仍結合於近端H2A-H2B。FACT DD移位至核小體二分位，而Pob3 MD也移位結合於核小體DNA的SHL （0至+0。5） 處。因此，EC49B反映的是FACT-核小體中間體向下遊“跳躍”的狀態。

本文獲得的後三個結構（EC58hex、EC58oct、EC115）代表著核小體在上游再組裝的細節：

在EC58hex中，EC的前導邊緣已透過原下游核小體的二分位，此時EC下游已不再有核小體的密度，但在EC上游出現一個亞核小體的密度。FACT結合的組蛋白被置於DNA上，位於EC的DNA出口處，此處位於核小體初始位置的上游約45bp。此時組蛋白僅被約40bp的DNA片段包裹，代表的是上游核小體再組裝的早期階段。Spt4、Spt5 KOW1結構域、Spt6 YqgF和DLD結構域、Leo1 C端螺旋、及Rtf1 Plus3結構域構成DNA出口的邊緣，為FACT-組蛋白六聚體提供一個“搖籃”。Spt16 MD與Spt5 KOW1結構域、Spt6 DLD結構域互作，FACT DD與Rtf1 Plus3結構域互作。背面遠端的H3與Spt4的酸性表面直接互作。

在此FACT-組蛋白六聚體中，組蛋白被Spt16和Pob3 MD包夾著，Spt16 MD結合組蛋白的方式類似EC49。Spt16 MD的HA1螺旋與遠端H3-H4的鹼性表面互作，因此只有在DNA不結合H3-H4時才可發生。Pob3 MD結合組蛋白的方式不同於EC49，直接與H3-H4四聚體表面互作，這與H2A-H2B的結合位點部分重合，很可能只有近端H2A-H2B缺失時才可發生，因為此時沒有空間位阻。此時FACT DD位於一箇中間態位置，可能源於前述spt16和Pob3的空間位阻。故，此結構代表的是FACT-組蛋白轉移的中間體狀態。

在EC58oct中，EC位置不變，但組蛋白已變回八聚體。因此EC58oct可能代表的是近端H2A-H2B組裝到EC58hex的狀態。此時纏繞組蛋白的DNA約75bp，FACT-八聚體結構類似EC49，儘管這裡近端H2A-H2B的整個表面已被DNA纏繞。不同於EC58hex，Pob3 MD此時已離開H3-H4四聚體介面，表明H3-H4只能被Pob3 MD或H2A-H2B之一結合。

此時，上游DNA稍有彎曲，FACT-亞核小體的取向發生變化，較EC58hex旋轉約70°。該變化源於組蛋白由六聚體恢復八聚體，隨著DNA結合於近端H2A-H2B，組蛋白八聚體需要改變角度以防與DNA衝突。這時，FACT-亞核小體與EC搖籃的互作方式也發生轉變：Spt16 MD透過其HA1螺旋結合Spt6 YqgF結構域、Spt5 KOW1結構域，暴露的遠端H3-H4靠近Spt DLD結構域，FACT DD維持與Rtf1 Plus3的互作。

在EC115中，核小體已在EC上游接近組裝完成。此時，相較EC58，核小體向下遊移動約15bp，表明核小體已適應一段更合適的DNA區域。此時，組蛋白上纏繞的DNA約120bp，FACT已從核小體上完全解離，可能因為供FACT亞基結合的組蛋白亞基已被DNA纏繞佔據。遠端H2A-H2B僅剩的暴露表面被Spt4的酸性介面、Spt5 KOW1結構域結合。此時Leo1的C端螺旋也靠近H2A-H2B，因此，搖籃區可靈活地適應亞核糖體中間體的結構和取向變化，可能為核小體後續在EC上游的再組裝過程提供一個支援平臺。最後，作者還確認當Spt6、Spn1、Paf1C、FACT缺失時，無論在RNAPII上游還是下游都未觀察到明確的核小體結構，說明這些因子對上游核小體再組裝至關重要。

基於上述結構細節的分析，作者提出EC與FACT協作促進EC透過核小體的機制

（圖3）

：當EC靠近下游核小體時，啟動DNA從組蛋白上剝離。一旦近端H2A-H2B暴露，Spt16亞基的CTD開始結合組蛋白，但此時FACT大部分仍未結合核小體。直到EC前導邊緣靠近核小體二分位，DNA從近端H3-H4上解開，Spt16完全結合組蛋白，Spt16 MD及連線螺旋抓住組蛋白六聚體（H3-H4四聚體及近端H2A-H2B二聚體）；遠端DNA也同步解纏繞，組蛋白八聚體表面僅1/3覆蓋有DNA。隨著EC繼續前進，組蛋白與DNA解離以便後續轉移到上游DNA；此時FACT主體握住組蛋白六聚體，可能還透過其Pob3 CTD栓連著解聚的遠端H2A-H2B。隨後，位於EC上游側的搖籃區接手FACT握著的組蛋白六聚體。之前解聚的H2A-H2B再次結合六聚體，組蛋白八聚體再組裝。隨著EC繼續向前，釋放出的DNA再次纏繞於遠端H3-H4，並促使FACT解聚。在整個過程中，搖籃區不斷適應中間體的結構變化，支援核小體的上游再組裝。最終，遠端H2A-H2B也被DNA再次纏繞，EC上游形成完整的核小體結構。

圖3 轉錄延伸複合體透過核小體的結構模式圖

總結全文，

作者使用冷凍電鏡解析出一系列包含轉錄延伸因子Spt6、Spn1、Elf1、Spt4/5、Paf1C及組蛋白伴侶FACT的RNAP-核小體結構，透過對結構細節的分析歸納出核小體在EC下游解聚並在上游再組裝的分子機制。本研究獲得的結構為EC穿過核小體的同時保持染色質結構和表觀資訊提供機制解釋。

原文連結：

http://science.org/doi/10.1126/science.abp9466

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