文獻解讀｜單細胞時空轉錄組技術鑑定胎肝HSCMPP擴增單元

在哺乳動物中，造血幹細胞和多能祖細胞（HSCs/MPPs）佔據造血系統的頂端［1］，表現出多向分化和自我更新的能力。然而在目前的HSC/MPP體外擴增培養中，如何維持HSC/MPP的體外擴增依然存在挑戰。高度血管化的胎肝（FL）是各種來源造血細胞（HCS）的短暫發育場所。FL結構的生態位細胞，包括內皮細胞（ECs）、基質細胞和肝母細胞。然而，HSC/MPP和不同的niche cells之間複雜相互作用的機制，以及HSC/MPP擴增的系統調控網路仍然不清楚。為了研究HSC/MPP擴增的調控機制，文章結合單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）、空間轉錄組測序（ST）構建了小鼠FL的時空轉錄組圖譜，揭示了HSCs/MPPs的轉錄異質性，解碼了HSC/MPP擴增的結構和分子基礎。此外，跨物種比較分析確定了小鼠和人類FL血細胞產生過程中保守的和特異性的細胞和分子事件。

基本資訊

標題：Identification of HSC/MPP expansion units in fetal liver by single-cell spatiotemporal transcriptomics

材料：

小鼠胎肝（FL）在E11。5到E14。5之間隔天取樣

期刊：

Cell Research

發表時間：

2021年8月

方法：

10× Genomics scRNA-seq，10× Visium , Stereo-Seq

內容概述

現有研究對造血幹細胞和多能祖細胞（HSC/MPP）在其天然生態位內擴增的細胞和分子機制瞭解有限，因此，文章構建了小鼠胎肝（FL）的時空轉錄組圖譜。作者使用小鼠胎肝單細胞轉錄組資料揭示了三個轉錄異質性的HSC/MPP亞群，其中一個CD93富集的亞群表現出增強的幹細胞特性；與空間轉錄組資料進行綜合分析，鑑定了新的HSC/MPP“pocket-like”單位（HSC Plus），它由niche cells（肝母細胞、基質細胞、內皮細胞和巨噬細胞）組成，並富含生長因子。巨噬細胞在pocket-like單位顯著富集，後續巨噬細胞-HSC/MPP共培養實驗驗證了巨噬細胞和生長因子（MDK，PTN，IGFBP5）對MSC/MPPs擴增起到促進作用。人鼠跨物種分析表明，小鼠與人胎肝HSC/MPP之間存在保守的細胞間互作和擴增機制，但是轉錄特徵上存在差異。

具體研究內容解析

1.構建小鼠胎肝的單細胞轉錄圖譜

作者選擇E11。5至E14。5齡的小鼠胎肝（FL）每隔一天進行取樣。為富集HCs和ECs，作者使用熒光分選從胎肝中篩選出HCs、ECS、非造血，非EC細胞並按一定比例混合進行單細胞測序。經過資料質控，作者共獲得32449個細胞進行UMAP降維分析。根據基因表達特徵，共鑑定到18個HC細胞亞群和3個結構生態位細胞亞群，不同的細胞群均表現出不同的基因表達特徵，且他們的比例與發育階段動態相關。隨後，作者透過對四個發育時間點的細胞群進行差異分析和富集分析，構建了胎肝發育過程中HSCs/MPPs和結構生態位細胞在細胞組成動力學、細胞型別特異性基因表達及階段特異性生物學功能的整體理解。

Fig 1 發育中的小鼠FL的單細胞轉錄組圖譜

2. CD93富集的HSCs/MPPs增強幹細胞特性

為進一步剖析HSCs/MPPs的轉錄組特徵，作者聚焦在HSC/MPP1–3亞群來探索他們之間的根本差別。透過對HSC/MPP1–3亞群進行差異基因分析、GO功能富集分析和hscScore乾性打分分析，作者發現相較於HSC/MPP2–3亞群，HSC/MPP1亞群表現出了最強的幹細胞轉錄組特徵。此外，作者發現HSC/MPP1亞群特異性表達Cd93。為探究Cd93能否與其他HSC/MPP標記物（如Lineage– Sca-1+c-Kit+（LSK）， Flt3– LSK， and CD150+CD48– LSK （SLAM-LSK））進行組合來純化具有強大幹細胞特性的HSC/MPP，作者進行了隨後的實驗。作者發現E14。5的Flt3– LSK細胞可分為CD93+和CD93-細胞群，菌落形成單位（CFU）分析表明 CD93+（CD93+LSK， CD93+Flt3– LSK， and CD93+SLAM-LSK）細胞群表現出了更強的菌落形成能力。

Fig 2 CD93富集的HSCs/MPPs具有增強的幹細胞特性

3．整合scRNA-seq和ST解碼HSCs/ MPPs與生態位細胞之間的相互作用

作者使用CellPhoneDB構建了HSC/MPP-niche cell的相互作用網路，並聚焦niche cell與macrophages。除了一些已知的配體-受體關係對之外，作者也發現了一些新的與細胞生長、細胞因子識別、Notch訊號相關的配體-受體對。為探究單細胞所預測的訊號相互作用是否確實存在於解剖學上的組織細胞之間，作者對E14。5時期的組織製備了10x Visium切片。為了不偏不倚地顯示主要細胞型別的空間組織，作者透過對來自scRNA-seq的細胞型別特徵基因的每個spot分配一個富集分數來進行反捲積分析，而後根據前兩種細胞型別的富集分數顯示兩種spot模式（第一模式和第二模式），然後對映到原FL區域。與預期一致，紅細胞和成肝細胞在大多數部位的富集分數最高，表明他們是FL的主要細胞成分。為了明確HSCs/MPPs及其相互作用的生態位細胞的空間組織，作者認為spots只是一種可信的細胞型別，如果某種細胞型別超過閾值（HSC、MPP為80%，niche cell為70%），則將他們對映到原FL區域，隨後，作者還透過特異性基因表達對結果進行了驗證。結果表明，ST描述了FL的空間組織，以進一步解碼由scRNA-seq預測的細胞與細胞之間的相互作用。

Fig 3 整合scRNA-seq和ST解碼HSCs/MPPs和生態位細胞之間的相互作用

4．識別HSCs/MPPs擴增單元

為了確定細胞間相互作用的結構基礎，作者將HSCs/MPPs spots定義為內點（intra）， 內點周圍一圈spots為近端點（inter）， 其他spots為遠端點（distant），然後根據富集得分來識別各個spots的細胞型別（富集得分最高）。除了HSCs/MPPs外，內點得分最高的是EC，與HSCs/MPPs接近；肝母細胞和基質細胞分別在近端點和遠端點中得分最高；巨噬細胞在內點和近端點中的得分高於遠端點中的得分，因此巨噬細胞可以考慮是一種新的niche cell。為了量化比較HSCs/MPPs與其他niche cell之間的相互作用 ，作者定義了富集倍數的概念：即每一種spot型別富集打分的中位值與全部spots富集打分中位值的比值。結果發現，巨噬細胞在內點的富集倍數是11。52，在近端點的富集倍數是1。31；EC在內點的富集倍數是1。62；而肝母細胞和基質細胞的富集程度更低 。綜上所述，巨噬細胞是與HSCs/MPPs關係最密切的重要生態位細胞。

在分子水平，作者使用CellPhoneDB分析來預測相互作用訊號的空間表達，結果發現一些基因編碼的配體基因在內點和近端點中高表達，而對應的受體在HSCs/MPPs定位的spots中高表達，說明空間鄰近促進了訊號的相互作用，從而在功能上支援HSCs/MPPs的擴增。鑑於內點和近端點具有空間臨近和相互作用訊號豐富的特點， 作者將其定義為擴增單元，其中HSCs/MPPs位於spots的核心，與周圍的niche cell spots相互作用。

Fig 4 識別HSCs/MPPs擴增單元

5．niche cell在促進HSC/MPP擴增中的功能驗證

為了確定巨噬細胞在FL中如何調節HSC/MPP的擴增，作者首先探究了HSCs/MPPs與巨噬細胞的空間關係。免疫熒光實驗揭示了兩種空間模式，一種是HSCs/MPPs與巨噬細胞附著，一種是HSCs/MPPs被巨噬細胞包圍。後一種模式提示巨噬細胞可能透過形成一種“口袋狀”的結構來促進HSC/MPP的擴增。透過HSC/MPP與巨噬細胞及富含巨噬細胞衍生物MDK的培養基共培養，作者發現HSC/MPP擴增增強，而巨噬細胞耗盡則擴增減弱。為了確定哪種巨噬細胞型別與HSCs/MPPs密切接觸，作者分別使用了生物資訊學分析、免疫熒光成像和共培養實驗進行探究。結果表明Mac1和Mac2起源於HSCs/MPPs和EMP，在促進HSCs/MPPs擴增中發揮了重要作用。

除巨噬細胞之外，作者還在10x Visium ST結果中發現了內皮細胞與HSCs/MPPs在空間上的緊密聯絡。免疫熒光實驗揭示了HSCs/MPPs被內皮細胞包圍，並且，大部分HSCs/MPPs靠近被EphrinB2標記的動脈門血管，少部分靠近被EphB4標記的肝靜脈。HSCs/MPPs擴增實驗表明，在IGFBP5-和PTN補充的培養體系中，HSC/MPP的擴增更為顯著。

綜上所述，功能分析驗證了潛在的細胞-細胞相互作用和潛在的分子機制支援HSC/MPP擴增。

Fig 5 巨噬細胞促進HSC/MPP擴增

Fig 6 結構生態位細胞促進HSC/MPP擴增

5．小鼠與人FL血細胞生成的跨物種分析

為了分析人和小鼠的FL血細胞生成的保守性和差異，作者對小鼠FL的單細胞資料與近期發表的人FL單細胞資料進行了比較分析。資料整合分析和細胞型別鑑定結果表明，小鼠和人FL之間具有保守的細胞型別和造血分化途徑。為了比較人和小鼠兩個物種間HSCs/MPPs的轉錄組特徵，作者分別對兩個物種的HSCs/MPPs與其他細胞群進行了差異分析和GO富集分析，結果表明，兩個物種間HSCs/MPPs的轉錄組特徵總體上具有相似性，但對外界刺激的適應性反應也存在物種特異性機制。

Fig 7 鼠與人FL血細胞生成的跨物種分析

研究結論

文章的研究結果揭示了HSCs/MPPs的異質性、擴增的有利因素和結構基礎，以及在小鼠和人類中保守的擴增機制，為研究HSCs/MPPs的擴增提供了寶貴的資源。對這一資源的進一步分析將有助於闡明胎兒起源的血液系統惡性腫瘤的機制。

參考文獻

［1］ Yamamoto， R。 et al。 Clonal analysis unveils self-renewing lineage-restricted progenitors generated directly from hematopoietic stem cells。 Cell 154， 1112–1126（2013）

［2］ Identification of HSC/MPP expansion units in fetal liver by single-cell spatiotemporal transcriptomics［J］。 Cell research。

END

單細胞生信研發部 撰文

本文系歐易生物原創

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