“120萬一針的抗癌藥”到底有什麼秘密？

最近“120萬一針的抗癌藥”的新聞將CAR-T療法推到了百姓面前，多數人除了關注到其昂貴的價格，更多的是對這種新療法的好奇與疑問。

CAR-T療法從原理上來說並非難以理解，簡單的說就是對患者體內的T淋巴細胞進行改造，裝上“導航裝置”，對癌細胞進行精準打擊。而這項技術中涉及到多項分子生物學技術，如分選、轉導、擴增等等。今天本文要聊的就是與擴增有關的知識。

常說擴增，指的就是聚合酶鏈式反應（PCR），是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA複製。當採用PCR反應擴增出了高的複製數，下一步如何檢測就成了關鍵。

傳統的一代凝膠電泳 PCR、二代熒光定量 PCR是依靠標準曲線或參照基因來測定核酸量，僅能做到相對定量。在20世紀末Bert Vogelstein等人在美國科學院院刊PNAS上首次提出數字PCR，即Digital PCR（dPCR）。這一種基於泊松分佈原理建立的核酸分子絕對定量的新方法，它具有靈敏度高、精度高、抗干擾能力強等優點，被稱為第三代 PCR 技術。

數字PCR基本原理是對反應體系進行分隔，將一個含有核酸分子幾十微升的熒光PCR反體系隨機分隔成數萬微小獨立反應體系，核酸模板在這種分隔過程中被充分稀釋，使每個微滴單元包含一個或多個複製的核酸分子（即DNA模板）。

模板DNA分子進入各個小的反應體系的過程滿足泊松分佈規律，檢測擴增PCR產物的熒光訊號強度，有熒光訊號的單元判讀為”1”，沒有熒光訊號的單元判讀為”0”，直接數出DNA分子的個數。根據相對比例和反應器的體積，帶入泊松分佈計算，即可推算出起始模板DNA分子的核酸濃度，對其絕對定量。

數字PCR根據其反應單元的不同形式，主要可分為微板式、微腔式、微滴式三大類系統。目前市場上主要以微滴式、晶片式兩種形式為主。

作為第三代PCR技術，數字PCR的優勢主要體現在

高靈敏度，可實現單分子級絕對定量：將一個傳統的PCR反應變成了數萬個PCR反應， 在這數萬個反應單元中分別獨立檢測目的序列，不受標準曲線和擴增動力學影響，無需依賴於Ct值，提高了檢測的靈敏度。

高精度，高重複性，可檢測微小差異：dPCR使樣本之間保持完全隔離，可以有效防止樣品交叉汙染，減少移液過程，可從背景序列中檢測低丰度目的序列，具有高靈敏度的特點，使其特別適合在複雜背景中檢測稀有突變。

強耐受抑制物，適用於多種複雜樣本：血液、糞便、食品、土壤等樣本中含有大量PCR反應的抑制物，由於數字PCR把目的序列被分配到多個獨立反應體系中，顯著降低了背景訊號、抑制物對反應的干擾，擴增基質效應大大減小，適合於複雜樣本中基因表達的準確定量檢測。

數字PCR技術為不同場景下的多樣化核酸檢測需求提供了新的思路，尤其是在醫學檢驗方面，在感染性疾病早期檢測、癌症的液體活檢、無創產前檢查等領域展現出良好的應用前景。

隨著精準診療需求的增加，數字PCR國內外市場都比較活躍。國外各大公司均在積極佈局數字PCR業務。國內數字PCR行業起步較晚，大多公司尚處於早期規劃開發階段，但在其無可比擬的優勢面前，數字PCR成為了近年廣受關注的熱點領域之一。相信隨著如CAR-T療法等新型分子生物學技術進入廣大群眾的視線中，以數字PCR之類等技術必將迎來蓬勃的發展。