連線混合物中純化的靶DNA與切割的質粒載體摩爾比應為約1:1

如Wizard SV Gel和PCR Clean-Up System（Promega公司）、PureLink PCR純化試劑盒（Life Technologies公司）或QIAquik PCR純化試劑盒（QIAGEN 公司）。

1。使用按本方案材料部分概述方法設計的正向和反向引物產生100~ 200ng擴增目的片段。取少量樣品（約25ng）透過瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產物的大小。

2。用酚：氯仿抽提和乙醇沉澱，或透過使用商業產品如Wizard sV Gel 和PCRClean-Up System （Promega公司）、PureLink PCR純化試劑盒（Life Technologies公司）或QIAquik PCR 純化試劑盒（QIAGEN）， 純化PCR擴增的DNA。純化的PCR產物溶解在20uL∞TE （pH7。5） 中。

3。在20μuL°反應體積中，用1。0~2。0U相關限制性內切核酸酶消化約50ng純化的PCR產物。在最適溫度溫育反應物1h。

4。消化結束時，按步驟2所概述方法純化DNA。

5。將DNA溶解在10μL°水中。

6。在一個微量離心管中建立以下連線混合物：如果有必要，新增ATP至終濃度為1mmol/L。建立對照反應，包含上述列出的所有試劑，除了擴增的靶DNA。連線混合物中純化的靶DNA與切割的質粒載體摩爾比應為約1：1

7。在16C溫育連線混合物2h。

8。分別用10μL四水稀釋5uL°兩種連線混合物，轉化合適的抗生素耐藥性的感受態大腸桿菌菌株。