Motif 文庫篩選策略—精準定義轉錄因子結合 DNA 基序！鐘鼎生物

在基因轉錄調控研究的過程中，可以簡化為轉錄因子蛋白 TF 與 DNA 序列的結合問題。

為了解鎖上述奧義，經典的技術 Chip-seq 應運而生。但是在植物 科學領域，Chip 級別的抗體難以獲得，遺傳轉化材料的獲取週期較長， 阻礙了研究程序。

隨著生物技術的創新發展，特別是高通量測序技術的日益成熟， 近幾年湧現出 Dap-seq，Cut&tag，ATAC-seq 等一系列新的技術手段， 轉錄因子蛋白與 DNA 結合的面紗被一層層解開。轉錄因子蛋白捕獲結合的 DNA 片段，透過高通量測序獲得 peak 序列。結合基因組序列資訊及註釋資訊，經由 MEME 解析，可以獲 取與轉錄因子特異性結合的 motif sequence。

隨著研究的深入，新的問題隨之而來，

如何才能用實驗的手段， 證明轉錄因子的精準結合 motif 序列？

Motif 文庫篩選策略——精準定義轉錄因子結合 DNA 基序！

一、Motif 文庫篩選原理

Motif 文庫是基於酵母單雜的實驗原理逆向開發的一種實驗策略。 首先簡單介紹酵母單雜交的原理：利用啟動子中 DNA 序列能夠特異 性結合轉錄因子蛋白（TF）的這一特性。以 DNA 序列為誘餌，從酵 母文庫中篩選獵物蛋白（TF），只有當 TF 與 DNA 序列特異性結合， 啟動下游報告基因。

酵母單雜交原理

Motif 文庫的工作原理是誘餌與獵物角色互換，以轉錄因子蛋白 （TF）為誘餌，只有當 TF 與 Motif 文庫中特定 DNA 序列相結合時， 啟動下游報告基因，從而得到與 TF 結合的 Motif 序列。

二、TF鎖定靶基因流程示意

三、Motif 文庫使用說明

選用 8N 隨機引物建庫，插入到 pHis2 質粒的 MCS 區域（替換 sma I 位點，替換形式如下圖所示），理論的庫容量為 1X48，含有 65536 條 motif 序列。

Motif- Logo

四、Motif 文庫申請流程

鐘鼎生物已經構建了8N-motif文庫，無需耗費人力物力來重複構建。我們可以“免費”提供給您使用。

五、FAQ

1。

可以直接用Motif文庫篩選來替代Chip-seq， Dap-seq，Cut&tag實驗麼？

Motif文庫篩選的實驗策略如下所示：

轉錄因子蛋白誘餌+Motif庫——》 8鹼基DNA序列 ——》 調控蛋白

可以尋找到與轉錄因子蛋白（TF）結合的的motif序列，透過生信比對，從而明確下游可能調控的基因的。從這個維度上說，確實可以部分替代上述實驗手段，但是如果作為唯一篩選的依據，證據略顯單薄。此外，依據經驗還存在如下隱憂：

A、轉錄因子透過與基因組的調控區域結合影響下游基因的表達水平是一個複雜的生物學過程，效應因子協同、離子環境變化、轉錄因子蛋白本身的修飾水平變化都參與其中，而單雜作為體外實驗，酵母細胞中的轉錄因子與DNA結合，不能真實對映待研究宿主體內的結合狀況，因此所獲得的結合資料需要進一步驗證。

B、轉錄因子結合的DNA序列確實是保守基序，但是這個保守基序其實是一組數學的機率集合，而非唯一的序列，因此會存在大量的非特異性結合，導致下游驗證工作極其繁重。

C、轉錄因子與DNA序列的結合與調控不是同義詞，不能等同論處，直接透過8個鹼基的結合得到調控的結論是不恰當的。

D、Chip-seq DAP-seq和Cut&tag的結合的啟動子區域DNA片段，透過測序peak確認的長度約為300bp左右，能夠明確的指向特定的下游靶基因。而透過Motif庫篩，8個鹼基指向的下游靶基因數量太多。

綜上述，不推薦Motif文庫篩選的方案來替代傳統的研究轉錄因子調控實驗手段，但是其對motif序列的精準定位，是非常有價值的資料補充和佐證。

2。

motif文庫篩選實驗方法靠譜嗎？

這個世界上沒有絕對靠譜的實驗方法，從原理上來說，motif文庫的實驗理論依據是成立的，也有發表的文章來支撐這種實驗策略。但是我們從上述的問題回答中，您可以發現，我們一直在強調這個方法學本身的缺陷，只要我們將獲得資料應用到適當的場景，例如作為chip-seq的資料補充，這就是比較靠譜的。

3。

為什麼選8N文庫，有沒有6N，7N，9N，10N等各種長度的文庫呢？

從技術手段上來說，我們可以構建各種長度的Motif文庫。保守的motif基序，一般是6~8鹼基。

基序太短，特異性變差，我們無法獲得有用的motif資訊。而基序增加，看起來好處更多，但motif每增加一個N，庫容量增加4倍，雖然庫容只增加了4倍，為了確保檢測體系能夠相容庫容量的增加，不會發生motif單元序列大量丟失的狀況，檢測體系的容量並不是按照4倍來增加的，一般是按照3個數量級增加。也就是說，每增加一個N，檢測體系的能力需要增加64倍以上，常規實驗室酵母轉化體系的庫容上限為108，因此我們不推薦更大的庫容。

4。

Motif文庫是否需要做自啟用測試？

在單雜實驗中，作為誘餌序列的啟動子DNA系列，插入到誘餌質粒pHis2或pAbAi載體後，必須要進行自啟用的測試，才能用於下游篩庫工作。而在Motif文庫體系中，插入的motif序列只有8鹼基，基本沒有自啟用現象。而motif文庫篩選的原理是將誘餌質粒與獵物質粒進行互換進行逆向篩選，因此我們的自啟用檢測針對單一的獵物質粒進行。最終的篩選壓力由獵物質粒的抑制濃度來決定。