Cell：蒲慕明發表靈長類大腦的單細胞轉錄組、連線組和神經調控的文章

單細胞轉錄組分析促進了大腦中的細胞型別鑑別和細胞型別特異性連線組的繪製，有助於闡明大腦功能的神經迴路並透過神經調控治療大腦疾病。然而，我們缺乏對神經元型別/亞型有共識的定義，也缺乏複雜互連網路中因果關係的明確理解。

2022年6月21日，中國科學院腦科學與智慧技術卓越創新中心（神經科學研究所）/ 上海腦科學與類腦技術中心蒲慕明在Cell發表題為“Transcriptome, connectome and neuromodulation of the primate brain”的評論文章，該文章重點關注靈長類動物大腦的單細胞轉錄組學和連線組學研究，以及透過物理手段進行精確的神經調控，旨在調控各種大腦功能和功能障礙背後的特定神經迴路。

自從 Ramon y Cajal 提出神經元作為神經系統的基本單位以來，識別所有神經元型別並繪製它們在大腦中的連線圖譜一直是神經生物學家迫在眉睫的任務。

基於細胞形態、電生理特性、基因表達譜和連線模式對細胞型別進行分類的多種方法已經產生了大量資訊。單細胞 RNA 測序技術的最新進展極大地加快了基於轉錄組的細胞分類的步伐。細胞型別特異性病毒載體和光學成像技術的出現還允許繪製介觀神經連線組（mesoscopic connectomes），包括軸突全腦的投射模式（“投射組”）和單個神經元所接收的所有輸入神經連線（“輸入組”）。在基於轉錄組和基於連線組的分類中，細胞型別的數量隨著分析的解析度而增加，因此最終每個細胞都可能成為自成一類。

這就需要我們對定義細胞型別和亞型的標準達成共識，最好是一種可以整合各種分類方案所獲資訊的標準。

儘管目前尚未就細胞分型標準達成共識，但在過去十年中，在研究小鼠大腦的單細胞轉錄組和連線組以及來自表觀基因組、生理和行為研究的資訊方面已經取得了巨大進展。科學家們正在努力將單細胞轉錄組學研究從小鼠擴充套件到非人類靈長類動物 （Non-human primate， NHP） 和人類大腦。然而，在 NHP 中繪製單細胞連線組仍處於早期階段。

本評論重點關注靈長類動物大腦的單細胞轉錄組學和連線組學研究，以及透過物理手段進行精確的神經調控，旨在調控各種大腦功能和功能障礙背後的特定神經迴路的活動。

靈長類大腦的單細胞轉錄組

現在正在從 NHP 和人類大腦中獲得有關單細胞轉錄組的大量資料。在胚胎和成年小鼠和人類大腦的同源區域中發現了保守和差異的基因表達模式。與小鼠一樣，

需要整合靈長類動物大腦中形態、電生理特性和基因表達模式的單細胞資料。

針對於人類皮層內的穀氨酸能神經元，Berg 等人確實發現了它們的轉錄組模式和形態以及生理特性之間的一些對應關係。隨著這項工作的進一步進展，我們越來越需要統一定義細胞型別和亞型，這可以作為整合各種分類方法所獲資訊的基礎。

一種神經元型別或亞型應該有一些獨特的特徵為標誌， 而這些特徵在整個神經元的整個生命週期中都必須相對穩定；而在短時間尺度上持續的基因表達、生理特性和形態/連線性的變化可以被認為是神經元的不同狀態。

鑑定穩定且獨特表達的基因將有助於定義細胞型別，但迄今大多數單細胞轉錄組的分析一般都缺少有關轉錄組模式的時間變化的資訊。

已知在早期神經發生過程中不同轉錄因子組的表達決定了主要神經元型別的命運，即穀氨酸能神經元、GABA能神經元和調質神經元。透過對祖細胞進行並行標記以跟蹤小鼠前腦發育過程中的譜系關係和轉錄組特徵，Bandler 等人2022 年發現皮質 GABA 能亞型的分化是在祖細胞水平的就可以表現出不同。目前尚不清楚每種主要神經元型別的祖細胞群內的異質性在多大程度上可以解釋其後代的亞型多樣化，以及內在的譜系依賴性規則是否在決定不同大腦區域的所有神經元亞型中起主導作用。

我們可以合理地預期，

分化的神經元亞型的穩定基因表達模式與其在神經網路中的功能要求應該相匹配，而通常神經元的功能常是由其特定的連線性來決定的，並且匹配過程始於有絲分裂後神經元遷移到大腦中的指定位點並形成突觸連線。

Shibata 等人2021 年在發育中的小鼠大腦中發現了視黃酸的前後腦區的梯度及其匹配受體的表達，並且視黃酸活性是建立丘腦皮質連線所必需的。因此，早期神經發生過程中時空程式設計的基因表達可能不但決定了有絲分裂後神經元（Fishell 和 Heinz 所命名）的“基態”-定義了主要神經元型別， 而且也指導了神經元遷移、軸突/樹突生長和樹枝狀化，以及初始神經元連線性。隨後與區域性環境的相互作用以及依賴於電活動的神經連線的修剪和鞏固化，會賦予其獨特形態和生理特徵的神經元亞型的穩定基因表達的最終模式。因此，可以整合基於轉錄組和基於連線組的亞型分類的一種方式，就是在每種型別的神經元中發現一組獨特的、穩定表達的基因，同時這些神經元也表現出獨特的連線組模式。在靈長類動物新皮質中，鑑於其祖細胞的長期增殖和更復雜的細胞間相互作用和連線性，人們預計會出現比齧齒動物更多的神經元亞型。此外，基於穩定性的神經元型別/亞型分類標準必須能應用於經驗帶來的長期記憶，因為這些記憶涉及長期穩定的基因表達和突觸連線的改變。

長期記憶，特別是那些潛在的靈長類大腦高階認知功能，如面部識別和語言處理，是否涉及建立不同的神經元亞型？

空間轉錄組分析的快速發展現在允許以單細胞解析度繪製整個大腦的基因表達空間分佈圖。

大規模“stereo-Seq”技術現已應用於整個獼猴大腦，以確定皮層和皮層下大腦區域中各種以轉錄組模式定義的細胞型別的空間分佈。這種空間轉錄組學分析也將有應用於手術獲得或屍檢的人腦組織，並提供更精確的特定基因表達的空間定位，這些資訊理解人腦各種功能和功能障礙的基礎。結合組織學和基於 MRI 的資訊，空間轉錄組學分析還可以幫助產生更精細的腦區分割，為繪製靈長類大腦中所有神經元型別的神經連線圖譜提供基礎。

在動物的整個生命週期中縱向進行的空間轉錄組分析代表了一個很有意義的新研究方向，這將使我們能夠解決有關靈長類動物大腦進化、發育和衰老的許多重要問題。為了回答這些問題，

我們不僅需要鑑別在靈長類動物中特異表達的基因，還需要了解靈長類特異性的基因表達調控元件，這些元件決定了保守基因和靈長類特異性基因的獨特表達模式，以及它們對組織環境中細胞間相互作用和表觀遺傳因素的依賴性。

人類大腦發育期延長、皮層褶皺的形態發生以及人類特定功能（例如語言）的複雜網路的形成，可以極大地受益於特定基因何時、何地以及如何表達的知識。其中一些問題可以透過將轉基因和基因編輯技術應用於 NHP 來解決。

靈長類動物大腦的介觀連線組

雖然人腦的單細胞轉錄組分析可以在手術中獲取的樣本和屍檢組織上進行，但人腦介觀連線組的對映要困難得多，在活的人腦組織中進行細胞型別特異性探針的病毒表達以追蹤神經元連線，以及高通量成像和在單細胞解析度下大規模重建遠端投射，都有極大的困難。NHP 中的介觀神經連線組的繪製，例如狨猴和獼猴，目前較為現實。最近透過重建整個大腦超薄切片的熒光顯微影象，或改良的光學透明組織塊的光片成像，已經證實了獼猴大腦在微米解析度下遠端跟蹤單個神經元投射的能力。每個獼猴大腦的資料採集和處理工作量巨大，但似乎在一個可行的範圍內。另一方面，

闡明不同大腦區域內的區域性網路連線，繪製每種型別神經元的輸入組，是更艱鉅的挑戰。

以往的解剖學工作已經使用逆行熒光珠對獼猴大腦中的皮質-皮質投射進行了廣泛的研究。鑑定在 NHPs 的不同皮層區和大腦各區域內不同細胞型別中差異表達的基因，以及進一步闡明表達這些基因的特定的啟動子/增強子，將導致開發用於繪製細胞型別特異性神經連線組的分子示蹤劑。這種連線組資訊為進一步研究與不同大腦功能相關的神經元/迴路特異性活動提供了基礎。宏觀腦成像（例如，磁共振成像、MRI）已經在 NHP、正常人類受試者和腦部疾病患者中以毫米解析度生成了有關結構和功能連線性的大量資訊。相對較低的空間和時間解析度、影象收集和分析程式的變化以及個體差異性限制了這些成像資料在臨床環境中的有用性。NHP 大腦的介觀連線組分析，結合先前對同一動物的結構和 fMRI 成像，將有助於解釋從擴散張量成像推斷出的宏觀“結構連線組”。對特定大腦區域中特定神經元型別活動的光學成像和光遺傳學操作將進一步有助於解釋 MRI 研究推斷的“功能連線組”。

用於治療腦部疾病的神經調節

單細胞轉錄組和連線組分析的普遍目標是為監測和操縱特定神經元型別和迴路的活動提供基礎。然而，大腦疾病特異性神經元和迴路難以識別，特別是對於自閉症、抑鬱症和精神分裂症等精神類疾病，這些疾病涉及隨個體遺傳背景和發育史而變化的網路異常。在相互連線的神經網路中，特別是在關聯和額葉皮質中的神經網路中，很難破譯多個大腦區域相關活動之間的因果關係，也很難確定神經迴路是在主導還是僅僅調節特定的大腦功能。此外，異常的神經迴路源於神經元的異常連線，而這些神經元也包含在許多其他正常回路連線之中，因此靶向分子和細胞訊號轉導的藥物必然具有非特異性迴路作用。

人們越來越希望透過物理、生理和心理手段調節功能失調的網路（這裡稱為“神經調控（neuromodulation）”）可以提供腦部疾病的非藥物治療。

藥物或神經調控方法的開發需要更合適的動物模型。

迄今為止，一般是使用腦疾病的齧齒動物模型對候選藥物進行臨床前療效測試， 但最終能透過臨床試驗的藥物很少。由於 NHP 在許多解剖學和生理學特徵上與人類接近，使用狨猴和獼猴的疾病模型可能被證明是有價值且不可替代的。許多非侵入性神經調控工具，例如經顱磁刺激 （TMS）、直接或交流電刺激 （tDCS 或 tACS） 和超聲刺激具有較低的空間解析度和較差的目標特異性，這一問題可以透過使用較大尺寸的 NHP 大腦來部分解決。用於製作小鼠模型的轉基因和基因編輯方法現在正在擴充套件到 NHP。最近的一個例子是透過刪除獼猴胚胎中的核心晝夜節律基因 BMAL1 產生的晝夜節律紊亂的獼猴模型。這些 BMAL1 缺失的猴子表現出多種症狀，包括睡眠障礙、焦慮/抑鬱樣行為和精神分裂症樣腦電圖特徵，目前正被用於測試藥物和神經調節治療緩解特定精神疾病症狀的功效。

理想情況下，

使用神經調控的臨床治療應該基於對特定腦部疾病的特定功能障礙神經元和迴路的瞭解，目前這種情況在很大程度上是無法實現的。

從另一方面來說，即使不知道大腦疾病的“原因”，也可以使用神經調控來糾正“影響”（可觀察到的疾病表型），前提是原因和影響可能在複雜的神經網路中互為因果。例如，基於觀察到阿爾茨海默病 （AD） 小鼠模型中的伽馬振盪減少，Martorell 等人2019 年實驗表明，透過視覺或聽覺刺激誘導伽馬振盪可以減少整個新皮層的澱粉樣蛋白斑塊並改善記憶功能。

使用侵入性（例如，深部腦刺激，DBS）和非侵入性（例如，tDCS 和 TMS）方法的臨床神經調控研究表明，患者的治療效果存在很大差異，正如幾項關於 tDCS 治療中風患者運動缺陷的薈萃分析所表明的那樣。這種可變性可歸因於各種研究中使用的引數的差異，例如強度、時間、持續時間和調控部位，以及患者特定的顱骨解剖和神經迴路差異。在神經調控的臨床應用中，調kong時機的重要性尚未得到足夠的重視。最近對獼猴中風模型的一項研究表明，低頻硬膜外交流電刺激 （ACS） 會導致病灶周圍皮層中與任務相關的神經元叢集發生同步放電，從而提高了猴子在中風後的抓握靈活性。這可歸因於在抓握運動同時施加的 ACS 增強了抓握運動的神經迴路。因此，

當與患者發起或治療觸發的目標行為啟用同時進行時，相對非特異性的神經調控可能會增強治療效果，即使確切的潛在神經迴路仍然不清楚。

考慮到顱骨解剖結構和神經迴路配置的個體差異，需要對每個受試者大腦的影響進行定量模擬或測量，以實現更精確和有效的神經調製。

例如，將臨床反應對映到一系列焦點刺激可以幫助確定在使用 DBS 治療嚴重抑鬱症時有效的個性化刺激引數。在非侵入性 tCS 和 TMS 治療中，基於結構 MRI 資料的顱內電場分佈的個體特異性建模可以更精確地識別電流幅度和調控的大腦區域，基於 EEG 的腦電微狀態分析可以提供調控所誘導的、線上監測的大腦網路的動態變化。用計算建模輔助校準刺激引數，以及基於調控引起的大腦狀態變化或個體患者的即時臨床反應， 線上式的調整引數，可以為治療腦部疾病提供有效的精確神經調控。