專家點評 | 治癒地中海貧血新靶點！全新血紅蛋白轉換模型

點評 | 徐劍

（西南醫學中心）、

李大力

（華東師範大學）、

賴永榕

（廣西醫科大學）

責編 | 兮

地中海貧血是世界範圍內發病率最高的單基因遺傳病，每100個人中就有平均1。5個人攜帶地貧基因。其分子機制為編碼血紅蛋白的珠蛋白基因缺陷導致珠蛋白鏈合成障礙引起紅細胞破壞，造成溶血性貧血。目前中重型地中海貧血的治療面臨很大困境。隨著基因編輯技術的出現，地中海貧血的基因治療成為科學家不斷探索的目標。

在人發育過程中，血紅蛋白的β樣亞基會發生兩次轉換，由胚胎時期的ε轉換為胎兒時期的γ，最終轉換為出生後的β。其編碼基因，分別稱為ε-， γ-， β-珠蛋白，位於11號染色體的β-珠蛋白基因座中。人出生後，紅細胞中γ向β轉換的過程，被稱為珠蛋白轉換（Hemoglobin Switching），在過去近40年內被作為經典模型，研究基因轉錄的空間和時序調控。儘管經過大量的研究，γ-珠蛋白的抑制因子BCL11A直到2008年才透過全基因組關聯分析（GWAS）的手段被發現。BCL11A的發現具有里程碑式的意義，靶向BCL11A從而在成體紅細胞內重新啟用γ-珠蛋白，是極具潛力的治療地中海貧血症與鐮刀型貧血的方法，目前正在透過多項臨床實驗驗證。

近日，哈佛大學醫學院

Stuart H. Orkin

實驗室

劉楠

博士與山東大學齊魯醫院血液科副主任醫師

許書倩

博士合作在

Nature Genetics

雜誌刊發了題為

Nature Genetics

，的研究論文，

Transcription factor competition at the γ-globin promoters controls hemoglobin switching

劉楠博士在2018年透過蛋白結合晶片以及CUT&RUN技術發現，BCL11A結合位點是γ珠蛋白啟動子中的遠端TGACCA序列，使用CRISPR/Cas9破壞這個序列可以擾亂BCL11A結合，重新啟用γ珠蛋白，為基因治療鐮刀型貧血與地中海貧血提供了一個新的順式元件靶點

Transcription factor competition at the γ-globin promoters controls hemoglobin switching

。在新發表的

首次揭示了胎兒型血紅蛋白向成人型血紅蛋白轉換的轉錄因子空間競爭結合模型，有望為治癒地中海貧血的提供新的治療手段。

文章中，劉楠博士與許書倩博士進一步探討了BCL11A在遠端TGACCA的具體作用機理。

這項研究起源於一個與預期相反的結果。透過針對β-珠蛋白基因簇的飽和CRIPSR/Cas9篩選，作者希望尋找新的珠蛋白調控元件。對照實驗使用了缺乏核酸酶活性的dCas9分子。雖然dCas9無法切割DNA，但仍然可以與轉錄因子競爭，進而影響基因表達。當dCas9被靶向BCL11A結合位點的時候，與預期的γ-珠蛋白啟用不同，作者觀察到了γ-珠蛋白被進一步抑制。作者推測在BCL11A結合位點的附近可能有一個轉錄啟用因子的結合位點，dCas9間接抑制了這個啟用因子的功能。透過序列分析，作者發現了在BCL11A結合位點附近的兩個高度保守的CCAAT序列。CCAAT存在於30%的真核生物基因啟動子中，是一個重要的基因啟用元件，其結合蛋白是NF-Y

【1】

。透過shRNA和CRISPR/Cas9敲除，作者驗證了NF-Y確實啟用γ-珠蛋白表達。透過ChIP-seq和CUT&RUN，作者發現，在臍帶血來源的紅細胞（表達γ）中，NF-Y結合在γ-珠蛋白啟動子區，而在成人來源的紅細胞（不表達γ）中則不結和，進一步證實了NF-Y對γ-珠蛋白的啟用作用。作者進一步透過CUT&RUN足跡分析，發現僅有近TSS端的CCAAT是被NF-Y結合並保護的。透過CRISPR鹼基編輯的方法，作者將遠端TGACCA與近端CCAAT序列分別進行了定點突變，進一步驗證了遠端TGACCA是抑制性序列，而近端CCAAT是啟用性序列，分別由BCL11A和NF-Y控制。

為了進一步探討BCL11A和NF-Y這兩個功能相反的轉錄因子在γ-珠蛋白啟動子區的相互作用，作者建立了BCL11A急性敲除體系，並在其中觀察NF-Y以及其他染色質特徵的動態變化。作者首先將成人原代造血幹細胞/祖細胞在體外向紅細胞進行分化，並在分化至原成紅細胞階段時透過核轉染遞送Cas9/sgRNA複合物。在32小時後檢測到BCL11A已經大部分降解。透過CUT&RUN，PRO-seq，ATAC-seq，染色質構像捕捉等技術，作者發現，NF-Y在BCL11A消失後迅速結合在異染色質化的γ-珠蛋白啟動子區，隨後染色質可及性增加，增強子-啟動子相互作用增強，轉錄速率上升。

結合最初dCas9 screen的結果，以及考慮到BCL11A和NF-Y位點間僅24bp的距離，作者推測BCL11A可能透過位阻效應阻止NF-Y結合γ-珠蛋白啟動子。作者再次使用dCas9對這一假設進行驗證。透過將dCas9靶向γ-珠蛋白啟動子的不同位置，作者發現NF-Y對附近的dCas9非常敏感，即使遠在30bp以外的dCas9也可以直接阻止NF-Y結合。這與之前對NF-Y的結構分析與生物物理特性分析相符合

Nature Genetics

。

基於以上結果，作者提出了BCL11A抑制γ-珠蛋白的新機制。BCL11A在成體紅細胞中特異表達，它透過結合在γ-珠蛋白啟動子遠端TGACCA位點，直接阻止轉錄啟用因子NF-Y的作用進而實現珠蛋白轉換。這大大簡化了珠蛋白轉換的模型。與這個模型相符，作者透過鹼基編輯破壞了遠端TGACCA，促使NF-Y結合，進而重新激活了γ-珠蛋白，證實了鹼基編輯BCL11A結合位點可以作為一種治療地中海貧血與鐮刀型貧血的新手段。

哈佛大學醫學院

【2】

，山東大學齊魯醫院

【3-5】

為本文共同第一作者，美國科學院院士、霍華德休斯醫學研究所研究員、哈佛大學教授

劉楠

為本文通訊作者。

許書倩博士為山東大學齊魯醫院血液科副主任醫師，泰山學者青年專家，多年來一直從事血液系統疾病的基礎及臨床研究，主持及參與多項國家級、省部級課題，發表多篇高水平文章，其中包括血液學領域頂尖雜誌Blood，開發了多種針對特定基因型地中海貧血的CRISPR編輯策略，是世界範圍內第一次展示使用CRISPR-Cas9高效編輯地中海貧血患者造血幹/祖細胞剪接位點突變的可行性；第一次使用CRISPR-Cas12a/Cpf1編輯我國常見的IVS2-654C>T突變的地貧患者的造血幹/祖細胞；也是第一例透過CRISPR調控可變剪接進行基因治療的臨床前試驗，被

許書倩

雜誌評為期刊重點文章，被認為是地中海貧血基因治療的里程碑。

圖為許書倩與文章通訊作者Stuart H。 Orkin教授在哈佛大學醫學院波士頓兒童醫院/丹娜法伯癌症中心合影。

劉楠博士將於2021年6月入職良渚實驗室/浙江大學醫學中心開展獨立研究，研究方向為血液幹細胞發育過程中的表觀遺傳與轉錄調控機制，以及血液疾病的基因治療。誠邀有志之士加盟。招聘詳情請關注實驗室主頁：nanliulab。com。

Stuart H. Orkin

Blood

專家點評

原文連結：

（UTSW）

The study of hemoglobin switching not only serves as a paradigm for developmental gene regulation， but also has significant implications in developing new therapies for the major hemoglobin disorders， sickle cell disease （SCD） and β-thalassemia。 Dr。 Stuart Orkin’s lab initially identified a new regulator BCL11A in hemoglobin switching through genome-wide association studies （GWAS） 【6】。 BCL11A controls species-divergent globin switching【7】。 More importantly， inactivation of BCL11A is sufficient to ameliorate sickle cell anemia in humanized mouse models， establishing the first pre-clinical evidence for targeting BCL11A in treating hemoglobin disorders【8】。 In subsequent studies， an erythroid cell-specific enhancer for BCL11A was discovered【9】。 These studies paved the way for ongoing clinical development of gene therapies to target BCL11A or its enhancer for fetal hemoglobin （HbF） induction。 Two recent reports in New England Journal of Medicine described the highly promising clinical efficacy of targeting BCL11A using shRNA or CRISPR/Cas9 gene editing in treating SCD and β-thalassemia【10，11】。 These advances represent a major milestone in developing a curative therapy for the major hemoglobin disorders more than one century after the initial description of SCD【12】。

Despite these advances， the molecular mechanisms by which BCL11A controls HbF silencing and hemoglobin switching remained unclear。 In a previous study， Dr。 Nan Liu and colleagues in the Orkin lab made a breakthrough discovery that BCL11A occupies a distal ‘TGACCA’ motif （-118 to -113） at the γ-globin promoters to control the developmental silencing of HbF by direct promoter repression【1】。 However， how BCL11A counteracts transcriptional activation to initiate γ-globin gene repression and hemoglobin switching was not known。 In this study， Dr。 Nan Liu and colleagues employed multiple Cas9， dCas9， CRISPRi and CRISPRa-based saturating screens across the β-globin gene cluster， together with CUT&RUN and base editing， and uncovered a new mechanism that can explain the developmental control of γ-globin genes。 They found that BCL11A competes with NF-Y， a ubiquitously expressed transcriptional activator， through steric hindrance to initiate repression。 Using rigorous gene editing of BCL11A and/or NF-Y binding sites， coupled with refined kinetic analysis of gene expression and chromatin landscapes， Dr。 Liu provided convincing evidence that the fetal-to-adult globin switch is initiated by the competition between a stage-selective repressor （BCL11A） and a ubiquitous activator （NF-Y） within a 35bp region of the γ-globin promoters。

Together with Dr。 Nan Liu’s previous discoveries【1】， these findings established a parsimonious model for initiation of hemoglobin switching mediated by BCL11A， and provide new insights into TF competition as the underlying basis for the developmental control of γ-globin gene transcription。 More broadly， the findings described in this study establish a new example how evolutionary conserved mechanisms in gene regulation may be repurposed to control a critical developmental switch with significant relevance to human disorders。

徐劍 （Jian Xu）教授本科畢業於復旦大學，UCLA博士，博士後師從Dr。 Stuart Orkin研究關於造血幹細胞的表觀遺傳調控和血紅蛋白基因的調控機制。研究論文以第一或共同第一作者發表在Nature和Science等期刊上。其中關於血紅蛋白基因調控機制的研究發現和專利已經應用到針對鐮刀性貧血和地中海貧血基因治療的臨床試驗中。2014年加入西南醫學中心（UT Southwestern Medical Center），主要研究腫瘤基因組學，基因表達調控，表觀遺傳學和代謝，近幾年在

https://doi.org/10.1038/s41588-021-00798-y

，

徐劍

，

Cell

和

Nature Cell Biology

等雜誌上發表多篇研究論文。

專家點評

Cancer Discovery

（華東師範大學）

人類中血紅蛋白轉換是指胎兒血紅蛋（HbF）向成人血紅蛋白（HbA）轉換的過程，主要是胎兒期的表達的γ-珠蛋白基因轉錄被沉默而功能類似的β珠蛋白基因的表達被啟用而實現。血紅蛋白轉換髮生的機制研究一直是領域內的熱點，不僅為研究人類發育過程中的基因表達提供了一個模型，同時也具有重要的醫學研究價值，因為啟用成人中沉默的HbF是治療β血紅蛋白病（β地中海貧血和鐮狀細胞貧血）的重要策略。眾所周知，BCL11A作為轉錄抑制因子在血紅蛋白轉換過程中起著關鍵作用，透過基因編輯破壞BCL11A的紅系增強子元件可以高效解除成人中γ血紅蛋白基因轉錄的抑制，提升HbF。利用這一原理，2020年12月發表在《新英格蘭醫學雜誌》的工作表明，該策略能有效提升β地貧和鐮貧病人中血紅蛋白水平，擺脫輸血依賴。但是解除BCL11A蛋白對於γ-珠蛋白轉錄抑制是否足夠提升HbF蛋白水平，也就是說BCL11A依賴的轉錄抑制到底是如何發生的，在分子機制上還是很不清楚。這個工作首先利用了四種Cas9工具（負責編輯功能的Cas9，僅結合DNA佔位的dCas9，啟用基因轉錄的dCas9-VP64以及抑制基因轉錄的dCas9-KRAB）開展了 CRISPR篩選工作。透過對HBG啟動子106kb範圍內設計了近1萬個sgRNA的文庫，對高表達胎兒型血紅蛋白的細胞系進行了高通量測序篩選，發現了 dCas9 佔據γ-珠蛋白啟動子區BCL11A 結合位點反而降低了 HbF 的表達這一與預期相反的現象。進一步透過系列實驗證明了 BCL11A 可以與啟用性轉錄因子 NF-Y 競爭結合γ-珠蛋白啟動子，控制血紅蛋白轉換的空間模型。也就是說BCL11A 的結合會抑制 NF-Y 的結合，抑制γ-珠蛋白的轉錄，從而抑制胎兒型血紅蛋白的生成。該研究不僅回答了BCL11A如何調控血紅蛋白轉換過程等基礎分子機制的問題，也提示透過編輯HBG啟動子BCL11A結合位點的策略治療β血紅蛋白病需要更加精細的編輯工具，否則有可能同時破壞BCL11A的抑制位點以及NF-Y的轉錄啟用位點，也解釋了HBG啟動子上這一序列的新功能。

專家點評

Nature Genetics

（廣西醫科大學）

β地中海貧血（簡稱β地貧）是人類最常見的遺傳性疾病之一，在我國也較為流行。目前有效的臨床治療有兩種選擇：一是輸血及祛鐵治療，其治療費用隨年齡的增長而遞增，經濟負擔很重；二是造血幹細胞移植，這也是目前重型β地貧臨床治癒的唯一方法。但是，白細胞抗原（HLA）相合供者的缺乏，移植費用的經濟負擔，移植後的併發症等限制了造血幹細胞移植的開展。在 1985 年，人類基因組計劃的先驅 Francis Collins 發現了一個突變，攜帶這個突變的人紅細胞中的胎兒血紅蛋白（Fetal hemoglobin，HbF）異常增加，地貧患者如果攜帶這個突變，貧血症狀明顯減輕，因為異常升高的HbF替代了一部分功能。根據這一現象，提出了啟用地貧患者體內γ-珠蛋白基因，提升HbF，達到治療地貧的目的。本研究揭示了γ-珠蛋白抑制因子 BCL11A 及活化因子 NF-Y 競爭結合在γ-珠蛋白的啟動子區控制珠蛋白轉換的模型，為這一治療思路提供了新的靶點，也為地貧的臨床治療拓展了廣闊前景。

李大力

1。 Liu， N。 et al。 Direct Promoter Repression by BCL11A Controls the Fetal to Adult Hemoglobin Switch。

賴永榕

173， 430-442。e17 （2018）。

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參考文獻

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