單細胞轉錄組測序+單細胞測序教你玩轉植物單細胞發文新思路！

為什麼有必要在植物中做單細胞測序

如果簡單地說，

單細胞測序

就是獲取單個細胞遺傳資訊的測序技術，似乎沒有多大的吸引力。那麼為了理解這個問題，我們換個方式提問，在植物中為什麼非要用

單細胞測序

不可？

世界上沒有兩片相同的葉子。對於多細胞生物來說，細胞與細胞之間是有差異的。當然了，這個差異可大可小。但是當老師的樣本存在下圖這樣一個情況，組織中不同細胞的基因和蛋白表達不同，為了檢測組織中蛋白或mRNA的表達水平，老師們可以透過Western blot和PCR或Bulk RNA-seq來實現。

但是用上述方法的話，老師們並沒有辦法區分這些的情況：目的蛋白只在10%的細胞中強表達，還是在50%的細胞裡中等表達，還是在所有細胞中弱表達呢？

舉個例子，當老師送的植物樣本，一個基因（gene1）可能在分生組織中上調了，在保護組織中下調了，但是bulk RNA 測序結果發現沒有區別，這樣的沒有區別其實是個假陰性，老師可以透過單細胞測序找出這種區別，進行更為深入的研究。

單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）技術

提供了在單細胞水平上觀測基因表達的方法，這樣可以更好地研究這些組織中不同的細胞型別。

那麼我們為什麼要在植物中做

單細胞測序

呢？我們可以看大這裡展示的擬南芥以及水稻的根組織，他們所包含的細胞型別是有一個很大的異質性的，而同樣擬南芥中，根組織和葉片組織細胞型別也是不同的，同一組織不同細胞型別間同樣具有不同的基因表達模式，這些異質性我們是可以藉助

單細胞測序技術

進行深入研究的。

植物中單細胞測序實際應用

隨著單細胞測序技術的突破，單細胞測序的時代已然到來。其技術已經大量發表在CELL、Nature、Science等高質量期刊中，其中大多數集中在人和動物方面。近年來，單細胞測序在植物方向上的應用也在逐步擴大，涉及的物種包括擬南芥、水稻，以及玉米，本文就帶大家一起看一下

由歐易生物助力發表的植物相關單細胞測序文章

。

首先是河南大學

孫旭武

教授課題組在

Molecular Plant

雜誌發表的一篇研究擬南芥氣孔譜系細胞發育程序的文章。

Molecular Plant

( IF 21.949 )

；

Pub Date :

2020-06-24；

材料：

5 日齡擬南芥幼苗子葉中分離的原生質體；

技術：

10×Genomics scRNA-seq、單細胞轉錄組測序

這篇文章思路首先是一個常規的細胞型別的鑑定，透過文獻調研作者最終定義了9種細胞型別，以及另外兩種不能使用已知的標記基因來確定的細胞型別。熱圖和小提琴圖分別對top10的基因進行展示。

由於植物marker基因鑑定尚不成熟，所以作者為了驗證top10 marker基因的可靠性，採取了以下2種驗證，

第一種方法透過研究top10的分子功能來推測細胞功能

。作者構建了bag6和bzip6的突變株，發現bag6突變株表面氣孔指數增加，推測BAG6參與調控氣孔的發育，進而推測Cluster 9是一群參與調控氣孔的發育的細胞。

以下是

第二種驗證top10 marker基因的可靠性的方法

：

2015年，Adrian那篇文章是用流式把擬南芥子葉分成了幾類細胞，然後回收這些細胞去做測序，公佈了測序資料集給大家用。這篇文章就是把Figure2A中top 10基因挑出來，看看這些基因在人家的哪個細胞型別的資料集中表達了。簡單來說是把Figure2A中top10的marker基因，對映到這兩篇文章中，看看這些基因在這兩篇文章中是不是也在同一個細胞型別在表達。

世上本無marker基因，top10基因用的人多了，也就變成了marker基因。舉個例子，PC（扁平表皮細胞）他沒有特定的標誌基因，這篇文章他把鑑定到的PC高表達基因和人家資料集比對，比對到了40%，也進一步可以說明細胞型別鑑定的可靠程度。

既然作者都用這麼多方法證明了細胞型別鑑定的可靠性了，那麼就可以放心開展接下來的研究了。為了發現參與調節氣孔譜系細胞早期發育的潛在TF，作者統計了在不同細胞型別中顯示高表達的TFs。unknown （u。k。）_1 中 TFs數量最多，MPC_5中TFs數量最少。不知道大家記不記得，透過文獻調研作者最終定義了9種細胞型別，以及另外兩種不能使用已知的標記基因來確定的細胞型別。

Cluster 9這群不為人知的細胞前面作者已經推斷好了，他是參與調控氣孔的發育的細胞。這裡發現Cluster 1是一群參與氣孔早期發育的基因。那話不多說我們接著看下去。

MMC，LM，EM和GMC均是氣孔的發育早期的重要細胞。因此作者著重研究MMC，LM，EM和GMC四種細胞共表達基因的轉錄因子調控網路。分析結果表明ATML1， BPC1， BPC6， SCRM， PIF5，and WRKY33 可能是調控MMCs、EMs、LMs和GMCs中靶基因的表達的核心轉錄因子。

透過文獻調研，發現BPC蛋白和WRKY33是參與調節幼苗生長髮育和脅迫反應的重要TFs。而BPC1，BPC2，BPC4，BPC6和WRKY33的表達在MMC，LM，EM和GMC中表達也相對很高。

綜合這些因素，於是作者又研究了BPC蛋白、WRKY33和這次鑑定到的共表達轉錄因子和已知關於這四種細胞的轉錄因子之間的調控關係。結果發現BPC1和BPC6可能透過這些相互作用調控早期氣孔譜系細胞的發育。

為了研究已鑑定的TFs對氣孔譜系細胞發育的影響，作者分析了它們的表達特徵圖。發現BPC1、BPC2、BPC4和BPC6的表達主要在MMCs、EMs和GMCs中增強，而WRKY33在所有細胞型別中均可檢測到表達。於是作者構建了WRKY33突變株，發現WRKY33突變株的M 和 GMC 細胞比例上升，但 GC 細胞比例下降，表明 BPCs 蛋白可能參與介導 M 到 GMC 的發育過程，從而促進氣孔譜系早期發育。作者構建了BPC突變株，也發現了同樣的規律。

最後為了分析氣孔分化過程中的發育軌跡，作者使用 Monocle 2 軟體對

scRNA-seq 單細胞轉錄組測序資料

進行了擬時序分析，擬時序路徑共有三個分支。總體來看，從 MMC 到 GC 可以看到氣孔譜系細胞的不同發育過程。

這篇文章作者對擬南芥氣孔譜系細胞發育過程進行了

單細胞轉錄組測序

分析，鑑定了氣孔發育過程中各細胞類群顯著表達的 marker gene，並分析了其所參與的 GO 功能。為了分析氣孔細胞早期發育階段的基因表達調控機制，構建了氣孔分生母細胞中基因表達的轉錄因子調控網路。進一步透過分析所鑑定的標記基因和轉錄因子的擬南芥突變體的氣孔發育表型，確定了這些基因在調控氣孔發育中所扮演的重要角色。這項研究為利用

單細胞RNA-測序技術

在鑑定新的標記基因，以及解析氣孔譜系細胞發育的調控機制提供了新的研究思路和技術體系。

接下來這篇文章是

福建農林大學

等單位的研究人員在水稻葉片原生質體中構建了TF（OsNAC78）的差異表達系統，對構建好的原生質體進行

scRNA-seq

。

Frontiers in Plant Science

(IF 6.627)

；

Pub Date :

2020-11-16；

材料：

MH63水稻幼苗原生質體；

技術：

10×Genomics scRNA-seq單細胞測序

這篇文章老師重點是利用

單細胞測序

來篩選轉錄因子的一個靶基因。

老師為了研究OsNAC78這個轉錄因子的靶基因，將OsNAC78過表達到MH63水稻幼苗中，對照組為野生型MH63水稻幼苗。

透過對OsNAC78高表達的細胞進行細胞亞型分析，發現cluster1和cluter4一個是表達OsNAC78最多的cluster一個是表達OsNAC78最少的cluster。

於是作者針對cluter1和4做了一個差異分析，將cluster4中上調的19個候選基因基因單出拎了出來。

隨後作者透過過表達OsNAC78，看看有哪些基因可以隨著OsNAC78的過表達也跟著上調。結果篩選出了兩個基因。然後我們透過文獻調研等手段構建了一些Os01g0934800 和 Os01g0949900啟動子的報告質粒，然後

酵母單雜

來篩OsNAC78會和哪個啟動子結合，找到啟動子後。作者又做了EMSA和熒光素酶報告實驗，驗證了一下Os01g0934800 和 Os01g0949900確實是OsNAC78的靶基因。

2022年2月26日，河南大學

孫旭武

教授團隊在

The Plant Journal

雜誌發表了一篇透過對擬南芥幼苗子葉的單細胞測序，揭示了子葉葉脈的早期發育動態的文章。

The Plant Journal

( IF 7.091 )

；

Pub Date :

2022-02-26；

材料：

擬南芥3天齡子葉原生質體；

技術：

10×Genomics scRNA-seq單細胞轉錄組測序

這篇文章作者重點關注葉脈的發育調控機制，其中涉及到一些篩選葉脈發育中被啟用基因的方法（

方法1：

透過每組top10的基因，構建基因突變株進行篩選；

方法2：

透過研究重點關注細胞型別中的轉錄因子調控網路，篩選出核心的轉錄因子，構建基因突變株進行篩選）。

這篇文章思路首先是一個

常規的細胞型別的鑑定

，透過文獻調研作者最終定義了9種細胞型別，以及另外1種不能使用已知的標記基因來確定的細胞型別。

將每個cluster間的差異表達基因去做了富集分析，也進一步可以說明細胞型別鑑定的可靠程度。

為了篩選葉脈發育中被啟用基因，作者將每個cluster中top 10的基因構建基因的突變株，隨後進行葉脈發育的實驗，結果表明，紅框圈出來的基因在葉脈發育過程中被啟用。

為了進一步分析子葉葉脈的發育調控機制，研究接下來分析了特定組織細胞的轉錄因子調控網路。在 PP、CC_4 和 XP 中鑑定到的核心轉錄因子分別是CDF5、ERF15 和 RGA。透過比對別人文章的DAP-SEQ（DNA親和純化測序），發現CDF5 靶基因。隨後對CDF5 靶基因進行 GO 富集分析。透過對野生型和CDF5 突變植株葉片中CDF5下游靶基因進行qRT-PCR，發現突變體中CDF5 靶基因會下調，也進一步驗證了DAP-SEQ的結果。構建CDF5基因突變株，葉脈發育的實驗表明，CDF5的基因在葉脈發育過程中被啟用。

最後作者為了瞭解葉脈分化過程中的發育軌跡，使用 Monocle 2 軟體對

scRNA-seq單細胞轉錄組測序 資料

進行了擬時序分析，並且透過RNA速率分析驗證，發現BS、XP和CC_8簇中細胞的RNA速度發生了很大的變化，認為這些cluster代表快速分化的細胞。與擬時分析結果一致，BS、XP和CC_8在擬時間後期富集，有可能與葉脈發育有關。同時擬時分析熱圖也展示了基因表達沿著擬時間軸的變化。

接下來是

南繁種業所生物育種研究室

發表的一篇玉米根尖細胞的單細胞轉錄組文章。

The Crop Journal

( IF 4.407 )

；

Pub Date :

2022-03-09；

材料：

B73-玉米幼苗根原生質體；

技術：

10×Genomics scRN

A-se

q單細胞轉錄組測序

作者為了識別硝酸鹽脅迫條件下，特異性硝酸鹽反應基因。利用含（硝酸鹽+）或不含硝酸鹽（硝酸鹽-）的培養液中生長的玉米根的

單細胞轉錄組

進行了分析。

這篇文章首先還是一個細胞型別的鑑定，F圖是一個marker基因的展示圖，G圖他是展示了不同聚類與中柱鞘和根毛的相關性氣泡圖，發現cluster8與中柱鞘的相關性程度高，而cluster5與根毛相關性程度高，也是符合細胞型別鑑定的一個結果的。Fig2給每個細胞型別做了一個功能富集分析。

於是乎作者利用slingshot algorithm研究了表皮和根毛的分化軌跡。可以看出根毛細胞是從表皮細胞分化而來的。對軌跡中100個最重要的基因根據基因表達模式進行層次聚類，聚類後得到了兩個gene cluster。很顯然gene 2 cluster 在兩個分支上是差異相對比較大。於是乎作者對這群基因又做了一次富集分析。這些結果並反映了根表皮細胞分化過程中的轉錄重組資訊，從而再現了根毛的發育過程。

文章的最後作者還把玉米的根和三個品系的水稻根但細胞轉錄組資料（文獻調研）進行了比對，C圖 發現了58個核心同源基因（保守基因）在兩個物種的根毛中均有高表達，並對這些基因進行富集分析，發現這些基因參與了根毛和表皮細胞的發育。D圖玉米和水稻分離根細胞的UMAP視覺化。

最後，由於植物細胞原生質體解離的成功對植物的生長狀態有較高要求，為確保植物取樣部位新鮮，

我們建議老師把生長狀態良好的活體植株直接運輸

，取材前與我們實驗室技術人員溝通好具體的取材部位和注意事項，將由小歐繼續培育植物樣本到實驗結束。

目前我們成功解離的植物樣本也是琳琅滿目（油橄欖、土豆、石斛、茶樹、桑樹、葡萄、大蒜、大豆、水稻等）… …快要能夠開一個小小的植物園了！

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