蛋白質N端和C端如何測定？

N-末端測定

1

、

二硝基氟苯法

（FDNB， DNFB）

：

Sanger

在

1945

年提出了這種方法，這是他的重要貢獻之一。用有機溶劑提取

DNP-

氨基酸後，可透過

層析

位置進行鑑別。

Sanger

用這種方法測定了胰島素的

N

末

端分別為甘氨酸和苯丙氨酸。

2

、

氰酸鹽法

：

1963

年，

Smyth

和

Stank

提出了一種測定

N

末

端的新方法。步驟如下

：

由於

乙內醯脲氨基酸不帶電荷

，可以透過離子交換

層析法

將其與遊離氨基酸分離

，

分離得到的

乙內醯脲氨基酸

可被鹽酸水解生成遊離氨基酸

，

透過識別這個氨基酸，我們可以知道

N-

末

端是什麼型別的氨基酸。

3

、

二甲基氨基萘磺醯氯法

：

1956

年，

Hartley

等人報道了一種測定

N-

端的靈敏方法，使用

1-

二甲基氨基萘

-5-

磺醯氯

，

簡稱丹磺醯氯

。它與遊離氨基末端相互作用，方法與

Sanger

的

DNFB

方法相似，產物為

磺醯胺衍

生物。

丹磺醯鏈酸具

有強烈的黃色熒光。該方法靈敏度高

（

比

FDNB

法高

100

倍，樣品體積小於

1

毫微克

分子

）

，

丹磺醯氨基酸

穩定性高

（

高於

DNP

氨基酸水解穩定性

）

，可透過紙電泳或聚醯胺膜層析進行鑑別。

C-末端分析

1

、

肼解法

：

這是測定

C-

末

端最常用的方法。多肽溶於無水肼中，在

100

℃下反應。結果，羧基末端的氨基酸以遊離氨基酸的形式被釋放出來，而肽鏈的其餘部分和

肼

形成了氨基酸

肼

。這樣就可以透過

抽提

或離子交換

層析

分離羧基末端氨基酸進行分析。如果羧基

末

端氨基酸側鏈含有天冬醯胺、谷氨醯胺等醯胺，則在肼解過程中不能產生遊離羧基

末

端氨基酸。此外，在肼解過程中應注意避免任何少量的水解，以免將釋放的氨基酸與最終分析混淆。

肼的結構式

2

、

羧肽酶水解

：

羧肽酶能

專一性

水解羧基末端氨基酸。根據酶解的

專一性

可分為羧肽酶

A

、

B

、

C

三種，在用羧肽酶確定末端時，需要提前進行酶動力學實驗，以選擇合適的酶濃度和反應時間，使釋放的氨基酸主要為

C

末

端氨基酸。