16s+非靶向代謝組學探究腸道微生物群和抑制通路緩解實驗性結腸炎

前言

2021年7月，內蒙古醫科大學在

Frontiers In Immunology期刊

發表的題為

“Kaempferol Alleviates Murine Experimental Colitis by Restoring Gut Microbiota and Inhibiting the LPS-TLR4-NF-kB Axis ”

的研究成果，透過

16S rRNA基因測序和GC-MS非靶向代謝組學

研究方法，探究了山奈酚抗潰瘍性結腸炎的潛在機制。

中文標題：

山奈酚透過恢復腸道微生物群和抑制 LPS-TLR4-NF-kB 訊號通路來緩解小鼠實驗性結腸炎

研究物件：

小鼠結腸、糞便、血液

發表期刊：

Frontiers In Immunology

影響因子：

7。561

發表時間：

2021年7月

合作單位：

內蒙古醫科大學

運用生物技術：

16S rRNA基因測序、GC-MS 非靶向代謝組學

研究背景

潰瘍性結腸炎（UC）是最常見的炎症性腸病（IBD），其特點是預後不良，症狀復發，有可能發展為結腸炎相關癌症，因此得到廣泛關注。它與腸粘膜屏障功能缺陷有關，且特徵之一是腸道微生物失調，因此調節腸道微生物群是一種可能的治療策略。山奈酚（Kae）是一種從多種藥用植物中提取的抗炎和抗氧化類黃酮，具有治療潰瘍性結腸炎的潛在功效，但其治療效果以及與腸道微生物群之間的聯絡機制尚未被完全瞭解。本文作者將山奈酚作為治療潰瘍性結腸炎的藥物，用於葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的結腸炎小鼠，以考察其治療效果並透過調節腸道微生物菌群和影響TLR4相關訊號通路的潛在作用機制。

研究思路

（點選檢視大圖）

研究方法

·實驗分組：

6周齡C57BL/6J小鼠，分為四組（對照組NC，山奈酚對照組Kae、誘導結腸炎組DSS和山奈酚治療組DSS-Kae），每組10只。

·評估結腸炎程度：

依據疾病評估指數及組織病理學結果

·檢測促炎因子水平：

酶聯免疫吸附測定、定量逆轉錄聚合酶鏈式反應

·組學檢測：

16S rRNA基因測序、GC-MS非靶向代謝組學

、免疫組織化學、腸道通透性的測量

研究結果

1.山奈酚可以減弱 DSS 誘導的小鼠結腸炎和觸發的促炎反應

結腸炎症評估結果顯示，DSS會引起小鼠嚴重的腸粘膜損傷（圖1），但口服Kae補充劑會減輕腸炎症狀，因此山奈酚可以減輕DSS誘導的小鼠結腸炎的症狀，減輕結腸損傷。

與對照組相比，DSS處理組結果表明，DSS引起血清中IL-1、IL-6和TNF-a水平顯著升高。但新增Kae，可以顯著逆轉升高趨勢（圖2A-C）。DSS處理組可以顯著增加炎症因子（如IL-1b、IL-6、TNF-a、COX-2、MCP-1和iNOS）的mRNA水平表達，同時抑制IL-10的表達（P<0。05）（圖2D）。

此外，DSS組模式識別受體TLR4和NLRP3以及訊號分子MAPK1和NF-kB的mRNA表達水平也升高。但服用Kae會強烈抑制結腸炎相關基因的轉錄，同時逆轉DSS對IL-10轉錄的影響。因此可以得知，Kae可能透過上調IL-10轉錄和下調炎症相關基因的表達，減輕了UC引起的炎症。

圖1 | 山奈酚減輕了 DSS 誘導的小鼠結腸炎的症狀

圖2 | 山奈酚對 DSS 和 Kae 治療小鼠組的炎症相關細胞因子水平的影響

2.山奈酚可預防腸屏障喪失完整性

為評估 Kae 給藥對腸屏障完整性的保護作用，測量了攝入的 FITC-葡聚糖的熒光光譜，並使用 qRT-PCR和免疫組織化學進行了緊密連線 （TJ） 基因表達水平的檢測。結果表明，與僅服用DSS小鼠相比，Kae處理組的腸道通透性有所改善（圖3A）。DSS處理導致ZO-1、occludin 和 claudin-1 表達水平降低，而在Kae處理的小鼠中，它們的表達與未處理的對照小鼠相似（圖 3B-E）。這些資料表明，Kae 透過維持腸道屏障完整起到抗炎作用。

圖3 | Kae可改善腸道通透性並增強腸道緊密連線蛋白的表達

3.山奈酚可重塑腸道微生物群的多樣性和豐富性

作者還透過

16S rRNA基因高通量測序

，揭示 Kae對腸道微生物群的影響。

實驗結果表明NC組的腸道微生物群組成與DSS組不同。聚類結果表明，DSS-Kae組位於與DSS組不同分支上，且靠近NC和Kae組（圖4E-G），表明服用Kae可維持小鼠的腸道微生物群落結構。

如圖5A所示，DSS處理會導致擬桿菌門和厚壁菌門菌群的丰度明顯下降，而變形菌門的丰度增加。但服用Kae 可防止厚壁菌門/擬桿菌門比率的降低（圖 5B）。LEfSe 分析也顯示，DSS 組中的致病菌的 LDA 評分大於4。但DSS-Kae組的有益菌得分較高（圖 5C和D）。

圖4 | 服用Kae可增加DSS處理後小鼠的腸道微生物群的多樣性和豐富度

圖5 | 山奈酚對腸道菌群分佈的影響

4.山奈酚Kae 對腸道微生物群相關代謝物起到調節作用

使用

GC-MS非靶向代謝組學

研究 Kae 補充劑對結腸炎小鼠糞便代謝特徵的影響。PLS-DA 和 OPLS-DA分析顯示，DSS和DSS-Kae 組小鼠的代謝特徵明顯不同（圖6A和B），鑑定出14種在DSS 和DSS-Kae組之間丰度差異顯著的代謝物。服用Kae 可大大增加 DSS 處理的小鼠 D-果糖 2，6-二磷酸、D-木糖、半乳糖醇、乳糖和 N-乙醯-5-羥色胺的表達水平（圖6C）。

通路富集分析表明，Kae 引起了與苯丙氨酸代謝、半乳糖代謝以及精氨酸和脯氨酸代謝相關的代謝途徑的重大改變（圖6D）。結果表明 Kae 對 UC的保護作用與微生物代謝物的調節有關。

圖6 | Kae改變了糞便代謝成分

5、山奈酚可抑制 LPS-TLR4-NF-kB 炎症通路的表達

DSS組小鼠血清中的 LPS 含量顯著增加，表明 DSS 引發了代謝性內毒素血癥（圖7A）。但DSS-Kae 組的LPS 水平顯著降低，表明 Kae 能夠緩解 DSS 誘導的內毒素血癥。免疫組織化學分析顯示 Kae 抑制了DSS誘導的 TLR4、MyD88、p-NF-kB-P65 和 NLRP3 的表達（圖7B）。因此Kae 的抗結腸炎活性可部分歸因於LPS-TLR4-NF-kBinflammatory通路的抑制。

圖7 | Kae抑制LPS-TLR4-NF-kB 訊號通路

6、山奈酚的抗結腸炎作用可能是由微生物群轉移引起的

為了進一步評估腸道微生物群及其代謝產物在Kae的抗炎中的作用，進行了FMT和共同住房實驗（圖8A）。結果表明，FMT顯著增加了DSS-Kae小鼠和DSS小鼠的結腸長度，降低了DAI評分，並減輕了病理特徵（圖 8B-F）。此外移植組血清的 IL-1b、IL-6、TNF-a 和 LPS 含量也降低（P < 0。05）（圖8G-J）。這些結果進一步證實了 Kae 對結腸炎的有益作用與其調節微生物群的能力有關。

圖8 | 響應 Kae 改變的微生物群移植概括了 Kae 治療對 DSS 誘導的結腸炎的影響

相關討論

很多研究表明，腸道微生物群多樣性和豐富度的下降與結腸炎患病率的增加相關，UC患者中厚壁菌門與擬桿菌門的比率 （F/B） 下降，而變形菌門的丰度顯著增加，這也是腸道菌群失調的標誌性特徵。

作者的研究發現，Kae 可以逆轉 DSS 治療小鼠的 F/B 比率。Kae 處理組透過降低變形菌的丰度來重塑微生物群的組成，同時一些益生菌例如 Prevotellaceae 和 Ruminococcaceae 門增加。

在消化過程中，腸道微生物群會產生大量代謝物。這些代謝物與腸上皮細胞相互作用，可進入迴圈系統，並在人類健康和疾病中發揮重要作用。有文獻表明本實驗發現的差異代謝物半乳糖代謝與維持細胞的能量攝入有關，而苯丙氨酸、精氨酸和脯氨酸的代謝與多種人類疾病密切相關。

用 FMT作者進一步證明了腸道菌群在調節 Kae 對 UC 小鼠的影響方面起著關鍵作用。腸道微生物的糞口移植的資料表明 Kae 的抗結腸炎作用可以在共同飼養的小鼠之間轉移，意味著腸道微生物群參與了Kae的作用機制。

微生物16S rRNA 基因的測序

表明，變形菌在研究的過程中變形菌起著關鍵作用。TLR4 是變形菌釋放的LPS 的特異性受體。本研究表明Kae可透過抑制 DSS 引發的結腸炎小鼠中LPS-TLR4-NF-kB 訊號傳導的啟用來抑制炎症相關介質的表達。

腸黏膜屏障的破壞是結腸炎原因之一，可導致腸道通透性升高，抗原、毒素和病原體從腔內環境滲入黏膜組織，導致炎症發作。作者發現與 DSS組相比，Kae-DDS組的腸道通透性降低。作者還證明 Kae 可以顯著恢復小鼠結腸炎模型中 ZO-1、occludin 和 claudin-1表達，可能恢復腸粘膜屏障的完整性。

圖9 | Kae 透過與 LPS-TLR4-NF-kB 核心途徑相關的腸道微生物群途徑發揮出色的抗UC作用

研究討論

腸道菌群失調與包括潰瘍性結腸炎UC在內的多種病理過程有關。瞭解這種關係對於充分利用微生物干預在臨床治療中的治療潛力至關重要。本文發現Kae 透過調節

腸道微生物群和多種代謝物

在UC小鼠中發揮免疫調節作用，從而抑制LPS誘導的 TLR4-NF-kB 訊號傳導。該研究結果證明了Kae的抗UC作用及其潛在的治療機制，併為使用天然產品預防炎症性疾病提供了新的見解。

小鹿推薦

本文是一篇非常典型的中研究藥有效成分治療疾病的機制文章，作者的實驗分組非常合理，並透過FMF（糞便移植）和同籠實驗，驗證了腸道菌群在疾病治療中發揮的重要作用。

16S rRNA基因測序和GC-MS 非靶向代謝組學雙平臺

的運用，結合免疫組化的實驗結果，比較完整地闡釋了山奈酚治療潰瘍性結腸炎的潛在機制，對於治療潰瘍性結腸炎提供了新的思路。同時，這篇文章簡單明瞭的實驗思路，也可為相關研究的老師們提供參考。

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