PNAS：萬向元教授與袁隆平院士團隊發現玉米雄性不育基因分子……

雄性不育基因是什麼

前言

2020 年 9 月 9 日，北京科技大學 & 北京中智生物農業國際研究院萬向元教授、湖南雜交水稻研究中心袁隆平院士為共同通訊作者，在 PNAS 雜誌（IF： 9。412）線上發表了題為“Molecular regulation of ZmMs7 required for maize male fertility and development of a dominant male-sterility system in multiple species”的研究論文，深入研究了玉米雄性不育基因 ZmMs7 的分子調控機制，並基於 ZmMs7 創制了不同植物通用的顯性雄性不育技術體系。

北京科技大學安學麗、馬彪、董振營與湖南農業大學段美娟為共同第一作者，文章中酵母文庫實驗由歐易生物完成。

研究背景

玉米是雜種優勢利用最為成功的作物之一。目前，玉米雜交制種主要透過人工或機械去雄，費時費力且成本高昂，因此雄性不育系是玉米雜交制種的關鍵技術。基於細胞質不育的三系法在玉米雜交制種中也有應用，但由於不育系是細胞質遺傳的，存在遺傳資源有限、育性不穩定等問題。因此，採用生物技術手段以利用雄性不育基因開發新的雄性不育體系，成為當前研究的重點，比如萬向元教授團隊之前所建立的玉米多控不育（MCS）系統。

ZmMs7 是一個編碼 PHD-finger 的轉錄因子，是玉米花葯發育中的關鍵調控因子，但其精細的分子調控機制仍待進一步研究。

研究內容

本研究報道了玉米雄性不育基因 ZmMs7 的分子調控機制，及其在多物種顯性雄性不育系統中的應用。ZmMs7 在玉米花葯中特異性表達，它可以作為轉錄啟用因子在絨氈層發育和花粉外壁形成中起到關鍵調控作用。ZmMs7 可以與玉米核因子 NF-Y 亞基相互作用，形成 ZmMs7-NF-YA6-YB2-YC9/12/15 蛋白複合物，透過直接結合啟動子區的 CCAAT box 啟用靶基因。ZmMs7 在玉米中由花葯特異性啟動子 p5126 過表達會導致顯性和完全雄性不育，但營養生長和雌性育性正常；進一步利用 p5126-ZmMs7 基因元件，成功構建了一個在玉米、水稻和擬南芥中通用型的顯性不育（DMS）技術體系。此外，ms7-6007 隱性雄性不育系和 p5126-ZmMs7 顯性雄性不育系在不同遺傳種質下都具有很高的遺傳穩定性，可用於玉米雜交育種。本研究為花葯和花粉發育的分子機制提供了新見解，併為作物雜交育種提供了一種有潛力的新技術。

研究結果

1. ZmMs7 基因是玉米絨氈層發育和花粉壁形成所必需的

ZmMs7 基因敲除系均表現為與 ms-6007 突變體類似的完全雄性不育（下圖 A），這表明 ZmMs7 基因是玉米雄性育性所必需的。在玉米花葯發育的不同階段分別進行電鏡觀察（下圖 B-D），結果顯示 ZmMs7 功能的喪失會導致絨氈層退化延遲、Ubisch 體發育異常和花粉壁形成，這些發育缺陷最終導致完全雄性不育。

圖片說明：A） ZmMs7 基因敲除系的表型；B） 花葯半薄切片分析；C） 掃描電鏡觀察花粉粒發育；D） 透射電鏡觀察花粉壁形成

2. ZmMs7 作為轉錄啟用因子調控玉米絨氈層發育和花粉壁形成

RT-PCR 顯示 ZmMs7 在花葯發育的四分體和遊離單倍體小孢子期特異性表達（下圖 A）。雙熒光素酶報告系統證實 ZmMs7 具有轉錄啟用活性（下圖 C）。利用轉錄抑制結構域 SRDX 融合抑制 ZmMs7 轉錄，可以顯著抑制玉米的花葯和花粉發育，導致完全雄性不育（下圖 D）。

RNA-seq 測序顯示，野生型 WT 與 ms7-6007 之間存在 1143 個差異表達基因，其中包括一系列與絨氈層和花粉壁發育相關的基因、脂代謝相關基因等。GC-MS 檢測顯示ms7-6007 花葯中總角質含量、角質單體含量顯著減少（下圖 F）。表明 ms7-6007 突變阻礙了角質的生物合成，改變蠟和內部脂肪酸的成分，從而影響了花葯壁發育和花粉壁形成。

圖片說明：A） 再花葯發育不同階段進行 RT-PCR 檢測 ZmMs7 表達量；B） ZmMs7 亞細胞定位；C） 雙熒光素酶報告細胞檢測 ZmMs7 的轉錄啟用活性；D） 利用 SRDX 抑制 ZmMs7轉錄的玉米表型觀察；E） wt 與 ms7-6007 的差異表達基因；F） G） wt 與 ms7-6007 的花葯角質、蠟質、脂肪酸含量比較

3。 ZmMs7 與 ZmNF-Y 亞基形成多蛋白複合物

ZmMs7 本身不具有 DNA 結合結構域，為了研究 ZmMs7 如何調控下游靶基因，利用酵母雙雜交文庫進行了互作蛋白篩選，結果顯示 4 個 NF-Y 蛋白（NF-YA6、NF-YC9/12/15）可以與 ZmMs7 結合，並且互作關係可以透過 Co-IP、Bi-FC 得以證實。並且酵母雙雜交、Co-IP、Bi-FC 顯示 NF-YA6 可以與三個 NF-YC 亞基 NF-YC9/12/15 互作。酵母雙雜交文庫篩選並經 Co-IP、Bi-FC 證實，18 個 NF-YBs 可以與 NF-YC9/12/15 互作，但不與 NF-YA6 或 ZmMs7 互作。RT-PCR 顯示，NF-YA6、NF-YB2、NF-YC9/12/15 在花葯發育的第 6-10 階段均存在表達。以上結果表明，ZmMs7 可以與 NF-YA6、NF-YB2、NF-YC9/12/15 形成蛋白複合物。

圖片說明：A） 酵母雙雜交和 Co-IP 實驗檢測 ZmMs7 與 NF-YA6、NF-YC9/12/15 的互作關係；B） 酵母雙雜交和 Co-IP 實驗檢測 NF-YA6 與 NF-YC9/12/15 的互作關係；C） 酵母雙雜交和 Co-IP 實驗檢測 NF-YB2 與 ZmMs7、NF-YA6、NF-YC9/12/15 的互作關係；D） BiFC 實驗檢測 NF-YB2、ZmMs7、NF-YA6、NF-YC9/12/15 間的互作關係

4。 ZmMs7-NF-Y 複合物直接啟用靶基因的表達

對上述 RNA-seq 篩選到的差異表達基因進行驗證，轉錄啟用實驗顯示 ZmMT2C 啟動子可以被 ZmMs7-NF-Y 複合物啟用。EMSA 實驗顯示 MBP-NF-YA6 可以特異性結合到ZmMT2C 啟動子中的 CCAAT box motif。ChIP-qPCR 也表明 ZmMs7 可以在體內結合到 ZmMT2C 啟動子。

ZmMT2C 的同源基因 OsMT2b 在水稻中參與花葯絨氈層的細胞程式性死亡。TUNEL 實驗表明在 ms7-6007 突變體花葯中絨氈層細胞的程式性死亡得以延遲，透射電鏡分析也顯示絨氈層的退化延緩。以上結果表明，ZmMs7 蛋白複合物可以透過靶向調節 ZmMT2C的表達調控絨氈層細胞程式性死亡。

圖片說明：A） 雙熒光素酶報告系統檢測 ZmMs7-NF-Y 複合物對 ZmMT2C 啟動子的啟用；B） EMSA 檢測 ZmMs7 與 ZmMT2C 啟動子中 CCAAT box 的結合能力；C） ChIP-qPCR 檢測 ZmMT2C 啟動子的富集程度；D） TUNEL 檢測野生型和 ms7-6007 突變體中 DNA 斷裂情況；E） 透射電鏡觀察絨氈層退化；F） ZmMs7-NF-YA/YB/YC 複合物透過直接啟用ZmMT2C 表達控制雄性不育的模式圖

5. 花葯特異性啟動子 p5126 驅動的 ZmMs7 提前表達導致玉米顯性雄性不育

過表達 ZmMs7 的同源基因，在擬南芥和大麥中可以導致顯性雄性不育。為了在玉米中建立顯性雄性不育系統，構建了一個 p5126-ZmMs7M 載體。轉入了 p5126-ZmMs7M載體的玉米表現出顯性雄性不育性，但其營養生長和雌性育性正常（下圖 A）。顯微觀察顯示，表達 p5126-ZmMs7M 破壞了花葯絨氈層和花粉壁的發育（下圖 C-F）。

圖片說明：A） – C） pull down 檢測 CO 與 TOE1 的結合；D） – I） 雙熒光互補實驗檢測 CO 與 TOE1 的結合；J） Co-IP 檢測 CO 與 TOE1 的結合；K） – L） semi-in vivo pull-down 檢測 CO 與 TOE1 的結合。

6. ZmMs7 的提前表達改變了玉米絨氈層和花粉發育相關基因的表達模式

與野生型對比，轉錄組測序發現 126 個基因在 p5126-ZmMs7M 轉基因植株中上調、在ms7-6007 突變株中下調（下圖 A），功能富集分析顯示這些基因對於花葯、絨氈層和花粉壁發育至關重要。RT-PCR 顯示，在 p5126-ZmMs7M 轉基因植株中，雄性不育相關基因均發生不同程度的提前表達（下圖 C）。

7. ms7-6007 突變遺傳穩定，適用於雜交玉米育種和制種

403 個玉米自交系材料為母本，分別利用 ZmMs7/ms7-6007 雜合子進行授粉，選擇雜交 F1 代中的 ZmMs7/ms7-6007 雜合個體再進行自交產生 403 個 F2 家系。對 F2 家系進行表型統計，其中 376 個家系中可育/不育植株符合 3：1 分離比，27 個家系偏離 3：1。並且利用 ms7-6007 特徵性 marker 證實雄性不育性狀的偏離在這 27 個家系中是穩定的。

同時，利用 31 個優質品系為父本，分別與 ZmMs7/ ZmMs7、ms7-6007/ms7-6007純合子雜交，對分別種植於 3 個地點的 F1 子代進行 17 個農藝性狀的統計，結果顯示所有雜交組合後代表型均大大優於它們各自的親本。以上結果表明，ZmMs7 基因及其突變體ms7-6007 適用於玉米雜交育種和制種。

將 p5126-ZmMs7M 轉基因植株與 392 個品系雜交，利用與 p5126-ZmMs7 偶聯的mCherry 熒光訊號作為篩選標記，結果顯示 392 個 F1 中正常顏色種子（即不含有p5126-ZmMs7 質粒）的植株都是雄性可育的，帶有熒光的種子（即不含有 p5126-ZmMs7 質粒）均表現為雄性不育。以上表明 p5126-ZmMs7M 誘導的顯性雄性不育相對穩定。

8. 玉米、水稻和擬南芥顯性雄性不育系統構建

將 p5126-ZmMs7M 質粒轉入水稻，水稻表現出正常的營養生長，但花葯較小、缺乏有活力的花粉。將 p5126-ZmMs7M 質粒轉入擬南芥，擬南芥花葯呈褐色、幾乎沒有花粉粒形成，沒有萌發能力。以上結果表明，利用 ZmMs7 表達系統，可以在單子葉植物（玉米和水稻）與雙子葉植物（擬南芥）中構建通用型的顯性不育（DMS）體系。

研究結論

本研究針對玉米雄性不育基因 ZmMs7 開展了深入探究：ZmMs7 可以與 NF-YA6、NF-YB2、NF-YC9/12/15 形成蛋白複合物，共同參與對靶基因 ZmMT2C 轉錄的直接啟用作用，進而調控玉米絨氈層發育和花粉壁形成。本研究構建了 p5126-ZmMs7M 表達載體，該表達系統可以在玉米、水稻、擬南芥中穩定表達，用於構建完全顯性雄性不育系。同時，在玉米不同遺傳種質背景下雜交實驗表明，ms7-6007 隱性雄性不育系和 p5126-ZmMs7 顯性雄性不育系都具有較高的遺傳穩定性。同時與 p5126-ZmMs7 偶聯的 mCherry 熒光訊號可用於進行轉基因種子的方便挑選。本研究為花葯和花粉發育的分子機制提供了新見解，併為作物雜交育種提供了一種有潛力的新技術。

參考文獻

X An， B Ma， M Duan et al。 Molecular regulation of ZmMs7 required for maize male fertility and development of a dominant male-sterility system in multiple species。PNAS 2020； doi： 10。1073/pnas。2010255117。

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鄭小辮兒 撰文

本文系歐易生物原創

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