基金專案：復甦植物牛耳草的快繁技術研究

基金專案：復甦植物牛耳草的快繁技術研究

基金專案：

國家自然科學基金（31900271）、貴州省大學生創新創業計劃專案（2018521259）。

方學蘭

牛耳草，是苦苣苔科旋蒴苣苔屬多生年草本植物，具有極強的抗旱和復甦特性，蘊藏豐富的耐旱基因資源，近年來已成為乾旱逆境研究的模式植物 。其獨特的脫水保護機制和復甦機能，透過基因工程手段可將特定功能基因用於改良和提高作物的抗旱特性 。由於自然生境中牛耳草結實率低，種子小、萌發能力差，其主要依靠無性生殖進行繁衍，因此室內繁殖困難，使得科研工作者在試驗室難以獲得持續穩定的試驗材料。利用植物細胞的全能性和牛耳草的無性繁殖習性，透過組織培養和分株繁殖探究建立牛耳草的離體快繁技術，能解決牛耳草野外採集困難和室內繁殖不易存活的難題 。

1 植物材料

試驗材料牛耳草採集於江西省宜黃縣二都鎮。選取根系完整的植株移植於通風、溼潤的環境中，待其長出 3~4 片新生葉，沿基部剪下無病蟲害的成熟功能葉，作為組織培養和分株繁殖的外植體。

2 方法

2。1 組織培養

2。1。1 培養基成分。愈傷組織誘導、出芽和生根的培養基，以 1/2 M S（M urashige & Skoog，Sigm a）培養基為基底，新增 3% 蔗糖、0。75% 瓊脂粉，pH 值調為 5。8，並分別新增不同濃度的 6-BA 和 NAA，設定激素濃度梯度及組合培養基進行試驗。

2。1。2 外植體消毒及接種。先用自來水沖洗掉外植體表面的塵土及雜物，然後置於盛有蒸餾水的培養皿中，用75% 的酒精棉塗拭外植體表面。隨後將外植體帶入超淨工作臺中，並放入 0。1% 的昇汞溶液中浸泡 3m in，再用無菌水沖洗 3～4 次，最後將外植體放在無菌濾紙上，吸乾水分。用無菌手術刀將外植體切成 1cm ×1cm 的接種塊，接種時將接種塊背面接觸培養基。

2。1。3 培養條件。於植物光照培養室中，設定培養溫度為 25±1℃，光照強度為 35 μm oL/m2·s的條件下進行連續光照培養。

2。1。4 煉苗與移植。待無菌苗長出 2～3 片葉片且根系完整後，開啟培養瓶蓋子，適應外界環境的溫度、空氣及光照 3～4d；然後將組培苗從培養瓶中完整取出，用流水沖洗掉根部的培養基，移栽到混合基質（珍珠岩：蛭石：泥炭土 =1∶1∶3）中，等長出新生葉片後，再移植到土壤中。

2。1。5 資料統計分析。利用 SPSS 20。0 中的 Duncan 和LSD 方法對所得的資料進行方差分析及多重比較。利用以下公式進行資料統計：汙染率 =（汙染苗數 /接種苗數）×100% ；無菌苗獲得率 =（獲得無菌苗數 /接種苗數）×100% ；出芽率 =（出芽外植體數 /接種外植體數）×100% ；增殖係數 = 形成的有效芽數 /接種苗數；生根率 =（生根外植體數 /接種外植體數）×100% ；移栽成活率 =（移栽成活株數 /移栽株數）×100% 。

2。2 分株繁殖

2。2。1 葉片誘導新生植株的分株繁殖。取植株長勢良好的牛耳草新生功能葉片，剪成 1cm ×1cm 方塊後，均勻平放在土壤表面，保持葉片背面接觸土壤，於植物培養室進行培養。控制室溫為 25±1℃，土壤溼度不低於85% ，光照強度 35μm ol/m2 ·s，光暗週期 16h/8h。培養6～8 周，帶有完整根系和葉片的新生植株即可長出，隨後進行移植擴繁。

2。2。2 匍匐莖的分株繁殖。在外界環境中，用鬆散溼潤的土壤掩蓋牛耳草的匍匐莖，保留莖的頂芽露出土面，待頂芽幼葉展開後，切斷老葉與匍匐莖的連線點，繼續培養數週，待頂芽長出新根，即獲得完整的新生植株，隨後進行移植擴繁。

3 結果與分析

3。1 牛耳草組織培養的適宜條件

透過不同濃度的 6-BA 與 NAA 進行組合探究，資料分析表明，以牛耳草成熟功能葉為外植體，其愈傷組織誘導的最適培養基為 1/2 M S+ 2。0 g/L 6-BA+ 0。1m g/L NAA；出芽誘導最適培養基為 1/2 M S+ 3。0 g/L6-BA+ 0。2 m g/L NAA；生根誘導最適培養基為 1/2 M S+0。1 m g/L NAA。

圖 1 牛耳草組織培養過程

3。2 不同栽培基質對牛耳草組培苗移栽成活率的影響

牛耳草煉苗後移入珍珠岩∶蛭石∶泥炭土 = 1∶1∶3 的基質中，並進行遮蔭保溼培養。統計資料表明，無菌苗移植成活率可達 83。56% ±2。76% ，且植株生長良好。

3。3 分株繁殖效果

圖 2 牛耳草葉片誘導新生植株的分株繁殖

資料統計分析表明，牛耳草成熟功能葉誘導新生植株進行分株繁殖效果較好，成活率較高，可達 80。36%±3。56% ，而且誘導週期短，6～8 周即可實現規模化擴繁（圖 2）。匍匐莖的分株繁殖成功率較高，週期最短，只需 3～4 周，但受限於匍匐莖的數量，故難以實現批次化擴繁。

4 結論

透過試驗探究，確定了牛耳草組織培養的適宜條件，其愈傷組織誘導的最適培養基為 1/2 M S+ 2。0 g/L6-BA+ 0。1 m g/L NAA；出芽誘導最適培養基為 1/2 M S+3。0 g/L 6-BA+ 0。2 m g/L NAA；生根誘導最適培養基為1/2 M S+ 0。1 m g/L NAA。同時透過葉片和匍匐莖誘導新生植株探索了牛耳草全新的分株繁殖技術，與組織培養技術相比，分株繁殖能顯著縮短快繁週期。