中科院發文從分子層面揭示乾旱脅迫下植物根冠比的調控機制

植物在其整個生命週期中受到來自周圍環境的各種脅迫。作為主要的非生物脅迫之一，乾旱嚴重影響植物正常的生長髮育。 “根冠比”是指植物地下部分與地上部分的鮮重或乾重的比值。植物無法自行移動，為了更好地在乾旱狀態下生存，植物進化出複雜的根系來從土壤中獲取水分和養分。植物可以透過改變根系的生長方向和側根分佈、增加根系生長和減少枝條生長，達到調整根冠比和最佳化根系結構的目的。然而對於乾旱脅迫下植物根冠比調控機制的研究仍然較少。2021年12月，中國科學院分子植物科學卓越創新中心趙楊研究組在Nature Plants雜誌發表題為“Phosphorylation of SWEET sucrose transporters regulates plant root：shoot ratio under drought” 的研究論文，從分子層面揭示了乾旱脅迫下植物根冠比的調控機制。

在長期的進化過程中，植物形成了嚴密且複雜的調控網路來應對乾旱脅迫。這些植物對乾旱脅迫的反應主要與植物激素訊號通路有關。乾旱脅迫會引起ABA途徑的啟用，生長素和脫落酸（ABA）共同控制向地性、向水性和側根生長。本文中，研究人員的實驗結果表明：在滲透脅迫下，野生型擬南芥根冠比增加，ABA突變體根冠比變化較小。作為地下的主要營養器官，植物根系依靠光合產物（如蔗糖）的轉運維持生長。在滲透脅迫下，野生型植株根部的蔗糖積累量增加，ABA突變體根部的蔗糖積累量減少。這些結果表明，乾旱脅迫誘導植物中ABA的積累，啟用ABA訊號途徑。在滲透脅迫下ABA對調節植物根冠比，促進植物根系生長，以及蔗糖積累和分配方面具有重要作用。作為主要的光合產物，蔗糖可以透過韌皮部從枝條運輸到根部。在蔗糖長距離運輸過程中，韌皮部蔗糖轉運蛋白SWEET11和SWEET12發揮重要作用，參與乾旱脅迫下植物根冠比的調控。研究人員在SWEET11/12中發現了兩個在乾旱脅迫下被SnRK2s蛋白激酶磷酸化修飾的絲氨酸殘基（第237和248位絲氨酸）。磷酸化發生在SWEET蛋白C末端，位於細胞質內，是潛在的調控區。SWEET11/12 的磷酸化可以增強蔗糖轉運，並有助於改善植物根系生長和提高抗旱性。即使在非脅迫條件下，模擬磷酸化SWEET的表達在提高植物根系生長的同時，還可以增強地上部分的生長。

蛋白質之間的相互作用（protein-protein interaction， PPI）是細胞進行一切代謝活動的基礎，植物的生長髮育及其應對各種生物或（和）非生物脅迫的生理活動主要透過細胞中的蛋白質來進行調節和控制。探究植物中蛋白質相互作用的研究方法，不僅可以瞭解和揭示蛋白質在植物物質轉運、訊號轉導和代謝調控中的功能，闡明植物蛋白質作用的複雜網路系統，對於提高作物產量，尤其是脅迫下的作物穩產也具有重要意義。這篇高分文章中研究人員使用

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進行Split-LUC測定，驗證了SWEET11 和 SWEET 12 與SnRK2的潛在相互作用，從分子層面揭示了乾旱脅迫下植物根冠比的調控機制。

植物蛋白質相互作用研究方法包括體內、體外及生物資訊學（in silico）等。體內研究方法包括酵母雙雜交系統（Y2H），雙分子熒光互補技術（BiFC， Bimolecular fluorescence complementation assay），螢光素酶片段互補技術Split-LUC（Split luciferase complementation assay），以及熒光共振能量轉移法（FRET）。體外研究方法（in vitro）包括蛋白質免疫共沉澱法（Co-IP），GST融合蛋白pull-down技術，串聯親和純化（TAP）技術和蛋白質微陣列（Protein microarrays）。這裡我們跟大家分享一些利用酶標儀檢測植物中蛋白質相互作用的方法，包括BiFC，FRET以及Split-LUC。

1. 雙分子熒光互補技術（BiFC）

BiFC技術是將熒光報告蛋白按照規則分成沒有熒光的兩個片段作為標記分子，將標記分子分別與誘餌蛋白和捕獲蛋白融合並在細胞內共表達，只有當誘餌蛋白和捕獲蛋白髮生相互作用的情況下，兩段不完整的熒光報告蛋白才會形成完整的報告蛋白，發出熒光。BiFC技術是目前最靈敏的蛋白互作檢測方法，使用具備熒光檢測功能的酶標儀可以對熒光訊號進行測定。

2. 熒光共振能量轉移法（FRET）

如果想要確定蛋白互作發生的位置，可以採用熒光共振能量轉移法（FRET）。FRET是距離很近的兩個熒光分子間產生的一種能量轉移現象。當供體熒光分子的發射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，並且兩個分子的距離在10 nm以內時，會發生一種非放射性的能量轉移，即FRET現象。獲得的光訊號可以在具備熒光檢測功能的酶標儀上進行檢測。熒光共振能量轉移法（FRET）能比較可靠地反映蛋白質相互作用時的距離，檢測到瞬時、較弱的蛋白質相互作用，並且可以同時檢測到兩個蛋白質在細胞內的分佈和作用位點。

3. 螢光素酶片段互補技術（Split-LUC）

Split-LUC技術是基於菸草瞬時表達的螢火蟲熒光素酶片段互補實驗，與BiFC技術的原理相似。Split-LUC 技術的原理是將螢火蟲螢光素酶分割成 N 端（nLUC）和 C 端（cLUC）兩部分， 這兩部分不會自發重組併產生作用。只有當分別與這兩部分融合表達的兩個蛋白間存在相互作用時，螢火蟲熒光素酶的兩部分在空間上相互靠近，從而重新形成熒光素酶，獲得酶活性。當加入特定的熒光素酶底物時，熒光素酶即可水解底物，產生熒光。使用具備化學發光檢測功能的酶標儀可以對光訊號進行測定。Split-LUC的優點是假陽性低，背景值低，結果可靠。相較於酵母雙雜交實驗在異源條件下檢測蛋白間相互作用情況，熒光素酶互補實驗能更好的反映植物生理條件下蛋白間互作情況。與同樣在植物生理條件下檢測蛋白間互作的FRET和BiFC相比，Split-LUC技術不受植物自發熒光的干擾，並且操作簡單。

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參考文獻：Chen， Q。， Hu， T。， Li， X。 et al。 Phosphorylation of SWEET sucrose transporters regulates plant root：shoot ratio under drought。 Nat。 Plants 8， 68–77 （2022）。