向日葵生物研發部關於植物乳桿菌、戊糖片球菌和雜菌率的測定！

1。原理

利用營養瓊脂培養基對樣品中枯草芽孢桿菌活菌數計數，利用MRS培養基對樣品進行乳酸菌總數計數，再利用LBS培養基選擇性培養計數植物乳桿菌活菌數，用乳酸菌總數減去植物乳桿菌活菌數即為戊糖片球菌活菌數。

2。培養基和稀釋液

按本標準規定的方法配製或購買商品化的產品。

除非另有說明，在分析中僅使用確認為分析純的試劑和符合GB/T 6682規定的二級水或相當純度的水。

2。1 MRS培養基

2。1。1 成分

蛋白腖 10g；肉膏 10g；酵母提取物 5g；K2HPO4 2g；檸檬酸三銨 2g；乙酸鈉 5g；葡萄糖20g；Tween80 1mL；MgSO47H2O 0。58g；MnSO4H2O 0。25g；瓊脂 15g。

2。1。2 製法

將上述成分完全溶解於1000mL蒸餾水內，調pH6。2-6。4， 121℃ 滅菌15min。

2。2 LBS培養基

2。2。1 成分

酵母浸粉 5。0g；胰蛋白腖 10。0g；磷酸氫二鉀 6。0g；硫酸亞鐵 0。034g；硫酸鎂 0。575g；葡萄糖 20。0g；乙酸鈉 25。0g；檸檬酸鈉 2。0g；硫酸錳 15。0g；吐溫-80 1mL；冰乙酸 1。3mL。

2。2。2 製法

稱取（吸取）以上各成分，加熱攪拌溶解於1000mL蒸餾水中，當日使用，無需高壓滅菌。次日使用，需118℃高壓滅菌15分鐘。

2。3 營養瓊脂培養基

2。3。1 成分

蛋白腖 10g；牛肉膏 3g；氯化鈉 5g；瓊脂 15g。

2。3。2 製法

將上述成分完全溶解於1000mL蒸餾水內，調pH7。3±0。2。 121℃ 滅菌30min。

2。4 麥康凱培養基

2。4。1 成分

蛋白腖 20g；乳糖 10g；牛膽鹽 5g；氯化鈉 5g；瓊脂 17g；0。5%中性紅水溶液5ml；0。01%結晶紫水溶液10ml；蒸餾水 1000mL。

2。4。2 製法

麥康凱培養基：將上述成分完全溶解於1000mL蒸餾水內，調Ph7。1-7。3， 121℃ 滅菌15min。

2。5 稀釋液

2。5。1 成分

氯化鈉 8。5g；蒸餾水 1000mL。

2。5。2 製法

準確稱量氯化鈉8。5g，置於1000mL容量瓶中，用蒸餾水定容至1000mL後， 121℃滅菌15min。

3。 儀器與裝置

3。1 天平：感量：0。01g。

3。2 震盪器。

3。3 高壓滅菌器：≥121℃。

3。4 生化培養箱：厭氧培養的，具相應的功能。

4。 樣品製備

按GB/T 14699。1的規定，採取有代表性的飼料樣品500 g，按四分法制備試樣。

5。測定步驟

5。1 樣品稀釋

準確稱取待測樣品10g，放入裝有90mL稀釋液並放有小玻璃珠的250mL三角瓶中備用。將三角瓶在旋轉式搖床上200r/min充分振盪20min，即成10-1稀釋液；再用1mL無菌吸管，吸取10-1稀釋液1mL移入裝有9mL稀釋液的試管中，充分混勻即成10-2稀釋液；再換一支無菌吸管吸取10-2菌液1mL移入裝有9mL稀釋液試管中，即成10-3稀釋液；以此類推，連續稀釋，製成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10等一系列稀釋度菌液，供平板塗布用。

5。2 塗布

用1mL無菌吸管分別吸取不同稀釋度菌懸液0。1mL，分別加至培養基平皿表面，用無菌玻璃刮刀將菌懸液均勻塗於瓊脂表面。JYE01樣品取10-7、10-8和10-9三個稀釋梯度，JYE02樣品取10-8、10-9和10-10三個稀釋梯度，JYE03樣品取10-8、10-9和10-10三個稀釋梯度，JYE04樣品取10-8、10-9和10-10三個稀釋梯度，每一稀釋度重複兩次，同時用稀釋液作為空白對照。

5。3 培養

將接種好的培養皿倒置於生化培養箱內，植物乳桿菌、戊糖片球菌於37±0。5℃培養48～72h，枯草芽孢桿菌於37±0。5℃培養16～24h。

5。4 菌落特徵

5。4。1 植物乳桿菌菌落特徵

菌落中等大小，微白色，溼潤，邊緣不整齊，直徑1-3mm，可有淡淡的暈。

5。4。2 戊糖片球菌菌落特徵

菌落較小，圓形，直徑1。0-2。5mm，乳白色，邊緣整齊，可有淡淡的暈。

5。4。3 枯草芽孢桿菌菌落特徵

菌落為扁平、邊緣不整齊、表面粗糙皺褶，汙白或微黃色。

5。5 菌落計數

5。5。1 計算公式

枯草芽孢桿菌活菌數（CFU/g）=枯草芽孢桿菌菌落平均數×稀釋倍數×10

植物乳桿菌活菌數（CFU/g）=植物乳桿菌菌落平均數×稀釋倍數×10

乳酸菌總數（CFU/g）=MRS培養基上菌落平均數×稀釋倍數×10

戊糖片球菌活菌數（CFU/g）=乳酸菌總數-植物乳桿菌活菌數

5。5。2 菌落計數辦法

只計算A。5。4（特徵）的菌落。

當只有一個稀釋度，其菌落數在30～300之間時，則以該菌落數乘以稀釋倍數。

若有兩個稀釋度，其菌落數均在30～300之間，應按兩者菌落總數之比值來決定。若其比值小於2，計算兩者的平均數乘以稀釋倍數；若大於2則計數其中較小的菌落數乘以稀釋倍數。

若三個稀釋度的菌落數均大於300，則應按稀釋度最高的菌落數乘以稀釋倍數。

若三個稀釋梯度的平均菌落數均小於30，則應按稀釋度最低的菌落數乘以稀釋倍數。

結果表示：每克樣品中的有效活菌數，單位為CFU/g，保留兩位有效數字。

6。雜菌率

6。1 雜菌計數

取稀釋後10-5、10-6、10-7樣品液0。1ml於麥康凱培養基上，充分塗布，待液體完全吸收後倒置於37℃培養箱中培養24小時。計數。

6。2 雜菌率計算公式

雜菌率（%）=（雜菌數/最高有效菌數）×100