阿爾茨海默症的病理機制——酵母雙雜交技術

維生素C（即抗壞血酸：AA）是人體正常細胞健康和發育所必需的一種基本微量營養素。人體細胞本身不能產生維生素C，需要透過腸道吸收和血液迴圈從周圍環境中獲取維生素C。小鼠可以在肝臟中合成一定量的維生素C，然後分佈到各組織中，但內源性合成的VC不能完全滿足小鼠腦細胞的代謝需要，小鼠大腦仍然依賴於腸道對維生素C的吸收及其迴圈。

大腦的高強度代謝活性使這個器官特別容易受到氧化應激和自由基損傷，VC作為人體內高效的抗氧化劑，當大腦中維生素C水平不足時會導致阿爾茨海默症（AD）病人認知能力下降加速，β-澱粉樣蛋白積累和沉積。因此瞭解大腦中AA的吸收機制，對理解不同疾病狀態下維生素C攝取變化的潛在病理機制具有重要意義。

在神經元中，AA的攝取依賴於人類鈉依賴性維生素C轉運體-2 （hSVCT2），這是大腦中主要表達的維生素C轉運體亞型。然而，目前對維生素C轉運體的工作方式知之甚少，也不知道它是如何在不同的細胞型別（包括對維生素C有高需求的細胞，如神經元）中定向調節轉運的。

2021年，加利福尼亞大學團隊在

International Journal of Biological Macromolecules

上發表的題為

“Calsyntenin-3 interacts with the sodium-dependent vitamin C transporter-2 to regulate vitamin C uptake”

的研究論文，利用

酵母雙雜交技術

，篩選到了hSVCT2的互作蛋白Calsyntenin-3（CLSTN3），研究發現該組相互作用對VC吸收具有正向調節作用，對預防衰老相關的認知衰退和AD具有重要的生理病理學意義。

文章思路與結果

酵母雙雜交篩選獲得了人VC鈉依賴轉運蛋白hSVCT2的互作蛋白CLSTN3

以hSVCT2 C端（567-650 aa）為誘餌，透過

酵母雙雜交篩選

成年人類大腦cDNA酵母文庫，結果獲得253個候選陽性克隆，PCR鑑定測序分析發現CLSTN3互作可信度較高，進一步透過Y2H一對一驗證，發現hSVCT2 C端（567-650 aa）與hCLSTN3 （507–639 aa）在-His/+10 mM 3-AT篩選條件下存在相互作用。

在哺乳動物細胞中驗證hCLSTN3與hSVCT2存在相互作用

透過Co-IP、Dual-LUC、細胞內共表達進一步驗證了全長蛋白hCLSTN3與hSVCT2在哺乳動物細胞中存在相互作用。

hCLSTN3對hSVCT2功能的影響

透過對比檢測hSVCT2單獨瞬轉SH-SY5Y，以及hCLSTN3和hSVCT2共同瞬轉SH-SY5Y後，細胞C-AA攝取情況，發現hCLSTN3和hSVCT2共表達可以增強細胞AA吸收水平。透過siRNA敲降hCLSTN3，發現細胞AA吸收水平明顯下降，但hSVCT2表達量不變，說明蛋白hCLSTN3對hSVCT2功能具有輔助作用，表現為可以透過與其互作，提高hSVCT2的

AA

轉運功能，但並不會調控其表達量。

在正常人及AD患者海馬體中SVCT2和CLSTN3的表達量差異

既往研究發現AD患者血漿維生素C水平低於健康人，本研究透過qPCR及WB檢測，發現在小鼠模型及AD臨床病人中，SVCT2和CLSTN3的表達量均低於正常個體。

Fig。 4 | Effect of AD on expression level of hSVCT2 and hCLSTN3 protein and mRNA in normal and AD hippocampus。

本研究結果表明hCLSTN3與hSVCT2相互作用，hCLSTN3表達與維生素C攝取呈正相關。這兩種蛋白在AD疾病狀態下下調提示AD患者的大腦中維生素C穩態受損。

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