黃連中鹽酸小檗鹼的提取純化及抑菌活性研究

滅菌唑抑制作物生長嗎

作者：未知

摘要 為了探究鹽酸小檗鹼在植物病原真菌方面的抑制作用，以黃連根粉為材料，採用酸水法提取和乙醇重結晶獲得鹽酸小檗鹼純品，採用生長速率法研究了鹽酸小檗鹼對常見植物病原菌的抑制活性。結果表明，鹽酸小檗鹼的提取率為3。3%，經高效液相色譜法測得其含量為93。56%；抑菌活性試驗表明，鹽酸小檗鹼在100 μg/mL時對玉米大斑病菌的抑制率達99。9%，EC50為8。20 μg/mL，表現出比藥劑對照惡黴靈和百菌清更高的抑制活性；進一步的試驗表明，與惡黴靈及百菌清相比，鹽酸小檗鹼對玉米大斑病菌的抑制作用具有持效期長的特點。關鍵詞 鹽酸小檗鹼； 提取純化； 含量測定； 抑菌活性中圖分類號： S 482。292 文獻標識碼： A DOI： 10。16688/j。zwbh。2019020Abstract The aim of this study is to measure the antifungal activity of berberine hydrochloride。 The root powder of Rhizoma Coptidis was used as material to obtain berberine hydrochloride， the purified product of which was successfully obtained through extraction by using acid-water method and recrystallization with ethanol， and the antifungal activity of berberine hydrochloride against phytopathogenic fungi was investigated using the mycelial growth rate method。 The results showed that the extraction rate of berberine hydrochloride was 3。3% and its content was 93。56% measured by HPLC。 The results of biological assay indicated that berberine hydrochloride exhibited an excellent antifungal activity against Exserohilum turcicum at the concentration of 100 μg/mL with an inhibition rate of 99。9% and EC50 value of 8。20 μg/mL， which were better than those of hymexazol and chlorothalonil， two commercially available agricultural fungicides。 Compared with hymexazol and chlorothalonil， the inhibition effect of berberine hydrochloride on E。turcicum had a longer effective period。Key words berberine hydrochloride； extraction and purification； determination of content； antifungal activity由真菌和細菌引起的植物病害嚴重影響作物的產量和品質，是造成巨大經濟損失的主要原因之一［1-2］。噴施化學抑菌劑是目前控制病害採取的主要手段，但存在食品安全、環境汙染以及易誘導病原物產生抗性等問題。因此，開發新型、安全、環保的農業病害防控技術是當前生產中亟待解決的問題［3］。已有研究證實植物多種次生代謝產物對病害具有良好的抑制作用［4-5］，透過植物獲取抑菌成分用於預防和控制農業病害的發生，具有低毒、安全、環境友好等特點，已逐漸成為現代農業中防治病害的一項新型措施［6-7］。小檗鹼又稱黃連素，一種常見的異喹啉生物鹼，主要以鹽酸鹽的形式廣泛分佈於植物中，尤其在毛茛科、芸香科、小檗科植物根莖中含量較高，如在黃連中含量最高可達10%，是一種理想的天然藥物資源，近年來關於它的生物學及藥理學十分廣泛［8］。文獻報道及臨床研究表明，小檗鹼具有廣譜的抗菌活性，它作為傳統中藥主要用於菌痢、胃腸炎、癰腫等細菌性感染疾病［9］，而在抑制病原真菌方面的研究和應用較少，尤其是植物病原菌防治方面。基於此，本研究選用黃連為原料，從中提取分離得到小檗鹼，利用液相色譜分析其含量，採用生長速率法測試了其對常見植物病原真菌的抑制活性，探討鹽酸小檗鹼對農業病原菌的抑制作用，為基於天然產物的植物源抑菌劑的開發提供科學依據。1材料與方法1。1 材料黃連塊根：購自寧夏銀川國有永吉藥店，將塊根粉碎成粉末狀，過80 目篩，儲存備用。供試菌株：玉米大斑病菌Setosphaeria turcica，枸杞根腐病菌Fusarium solani，馬鈴薯早疫病菌Alternaria solani，馬鈴薯幹腐病菌Fusarium sulphureum，小麥赤黴病菌Fusarium graminearum，蘋果腐爛病菌Valsa mali，番茄灰黴病菌Botrytis cinerea，西瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum。供試菌株中枸杞根腐病菌和西瓜枯萎病菌為寧夏特殊生境微生物資源開發與利用重點實驗室分離並鑑定，其餘病菌為西北農林科技大學植物保護學院饋贈。1。2 儀器及試劑儀器：1200型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；X-4熔點測定儀，鞏義市予華儀器有限責任公司；YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實業有限公司；ZF-2型三用紫外分析儀，上海市安亭電子儀器廠；HPS-250生化培養箱，上海恆科學儀器有限公司。試劑：鹽酸小檗鹼標準品，上海瑞永生物科技有限公司；惡黴靈及百菌清，純度≥98%，上海一研生物科技有限公司；薄層層析矽膠，青島市基億達矽膠試劑廠；色譜純甲醇，阿拉丁；色譜純乙腈，阿拉丁；其他試劑均為分析純。1。3 試驗方法1。3。1 黃連根中小檗鹼的提取、分離與純化及含量測定1。3。1。1 小檗鹼的提取、分離與純化準確稱取黃連根粉50 g，加入8倍量的0。5%硫酸水溶液，浸泡24 h，過濾，濾液用石灰乳調pH為10，靜置30 min後抽濾，濾液用濃鹽酸調pH為 3，再加入濾液量的10%固體氯化鈉，攪拌至溶液出現微濁現象為止，放置過夜。抽濾，濾餅用蒸餾水洗3次，50℃烘乾得鹽酸小檗鹼粗品［10］。粗品用熱乙醇重結晶即得精製的鹽酸小檗鹼，使用熔點測定儀測定其熔點，並採用鹽酸小檗鹼標準品做對照，矽膠薄層層析檢測鹽酸小檗鹼的純度。1。3。1。2 鹽酸小檗鹼含量測定［11］色譜條件：色譜柱為ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4。6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0。1%磷酸溶液（35：65）；檢測波長345 nm；柱溫為室溫；流速1 mL/min；進樣量為20 μL。標準品溶液的製備：精密稱取鹽酸小檗鹼標準品5 mg於10 mL容量瓶中溶解，超聲處理30 min，再取1 mL溶於10 mL甲醇即得標準品溶液，搖勻，用0。45 μm微孔濾膜過濾，濾液備用，即得0。05 mg/mL的標準品溶液，備用。樣品溶液的製備：精密稱取鹽酸小檗鹼樣品3 mg，置於10 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，然後取1 mL轉至10 mL容量瓶中，加10 mL甲醇溶解並製成0。03 mg/mL的樣品溶液。然後用0。45 μm微孔濾膜過濾，備用。1。3。2 抑菌活性測定採用生長速率法［12］測試目標化合物鹽酸小檗鹼對玉米大斑病菌、枸杞根腐病菌、馬鈴薯早疫病菌、馬鈴薯幹腐病菌、小麥赤黴病菌、蘋果腐爛病菌、番茄灰黴病菌、西瓜枯萎病菌8種病原菌的抑制活性。將鹽酸小檗鹼用少量丙酮溶解，加入PDA 培養基中，製成含藥平板。以加入丙酮溶劑為空白對照組，以惡黴靈和百菌清作為藥劑對照。將供試病原菌菌餅（直徑0。4 cm）分別接種於含藥平板上，於 （28±0。5）℃ 培養箱中培養4~9 d，觀察菌絲生長情況，並用遊標卡尺採用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率，並進行資料處理。抑菌率=（對照組菌落直徑-處理組菌落直徑）對照組菌落直徑-0。4×100%。2結果與分析2。1 小檗鹼的提取、分離與純化2。1。1 鹽酸小檗鹼的產率與純度試驗用酸水法提取鹽酸小檗鹼，並採用乙醇重結晶方法純化，重複3次，提取率為3。3%，試驗重現性好。經熔點測定儀測定其熔點為200℃。以鹽酸小檗鹼標準品為對照，利用矽膠薄層層析法點樣，氯仿∶氨∶甲醇=30∶1∶8展開，於三用紫外分析儀下觀察，目標化合物鹽酸小檗鹼與標準品在Rf值為0。62的位置上有相同的綠色熒光斑點，初步判斷其為鹽酸小檗鹼，且純度較高（圖1）。2。1。2 鹽酸小檗鹼含量測定標準品及樣品的HPLC的圖譜如圖2所示，從圖中我們可以看出鹽酸小檗鹼標準品在1。3。1。2條件下各組分分離良好，在保留時間為3 min時出現目標化合物鹽酸小檗鹼的色譜峰，峰面積為94。59%。相同條件下，供試樣品在3 min時出現對應的色譜峰，峰面積為93。56%，說明從黃連中提取分離純化的為目標產物鹽酸小檗鹼，且純度較高。2。2 鹽酸小檗鹼的生物活性2。2。1 鹽酸小檗鹼對常見病原真菌的抑制活性採用菌絲生長速率法測定100 μg/mL鹽酸小檗鹼及陽性對照100 μg/mL惡黴靈和100 μg/mL百菌清對8種植物病原真菌的抑制作用，結果如表1所示。由表1可知，在濃度為100 μg/mL時，鹽酸小檗鹼對馬鈴薯早疫病菌、番茄灰黴病菌、枸杞根腐病菌、蘋果腐爛病菌、馬鈴薯幹腐病菌、小麥赤黴病菌、西瓜枯萎病菌均都表現出較低的抑制活性，抑制率為7。2%~44。0%，但對玉米大斑病菌的抑制率為99。9%，表現出比陽性對照惡黴靈（82。8%）和百菌清（48。0%）更高的抑制活性。在所有供試病菌中，鹽酸小檗鹼只表現出對玉米大斑病菌高的抑制活性，這表明鹽酸小檗鹼在農作物病原菌抑制方面有可能是一種較專一性的抑菌劑，但本試驗的供試菌種數量有限，對其他病原菌的作用有待進一步研究。2。2。2 鹽酸小檗鹼對玉米大斑病菌抑制活性的持效性在2。2。1的基礎上，繼續觀察並記錄鹽酸小檗鹼及陽性對照惡黴靈和百菌清對玉米大斑病菌的抑制情況，每隔24 h觀察記錄1次，持續到第9天，其抑菌率如表2所示、抑菌效果如圖3所示。結果顯示，第4天和第9天，鹽酸小檗鹼對玉米大斑病菌的抑制率都均為99。9%，而惡黴靈的抑制率從82。8%下降為56。1%，百菌清的抑制率從48。0%下降為27。1%，由此可知，與惡黴靈及百菌清相比，鹽酸小檗鹼對玉米大斑病菌的抑制作用隨著時間的延長，抑制效果可維持不變，在離體培養下具有持效期長的特點。2。2。3 化合物對玉米大斑病菌的EC50測定按照1。3。2抑菌活性測試方法，測定了化合物鹽酸小檗鹼、惡黴靈和百菌清梯度濃度下對玉米大斑病菌的抑制活性，並根據抑菌結果計算EC50，結果如表3所示。化合物鹽酸小檗鹼表現出對玉米大斑病菌較高的抑制活性，抑制率為99。9%（表1），以惡黴靈和百菌清原藥為陽性對照，進一步研究了鹽酸小檗鹼在梯度濃度下對玉米大斑病菌的抑制效果，以濃度的對數作為x軸，以抑制率的機率值作為y軸，利用軟體SPSS 22。0求取毒力迴歸方程並計算半數效應濃度EC50，結果如表3所示。由表中可以看出，鹽酸小檗鹼對玉米大斑病菌的EC50為8。20 μg/mL，遠低於惡黴靈和百菌清對該菌的EC50值（惡黴靈和百菌清對玉米大斑病菌的EC50分別為11。92 μg/mL和13。52 μg/mL），表現出較好的抑制活性。3結論以黃連根粉為原料提取純化獲得鹽酸小檗鹼純品，提取率為3。3%；以鹽酸小檗鹼標準品為對照，利用高效液相色譜法測定其含量為93。56%；採用菌絲生長速率法對鹽酸小檗鹼的抑菌活性進行了研究，結果表明，在所有供試病菌中，鹽酸小檗鹼在100 μg/mL時表現出較專一的對玉米大斑病菌高的抑制活性，抑制率為99。9%，EC50為8。20 μg/mL，抑制活性高於陽性對照惡黴靈和百菌清；化合物對玉米大斑病菌持續抑制情況觀察表明，與惡黴靈及百菌清相比，鹽酸小檗鹼對玉米大斑病菌的抑制作用具有持效期長的特點。鹽酸小檗鹼作為一種在植物中含量較高的天然藥物資源，在抑菌方面表現出的這種專一性和較高的抑制活性，有待於我們進一步研究，為開發高效、低毒新型農用殺菌劑提供理論參考。參考文獻［1］ 康振生。 我國植物真菌病害的研究現狀及發展策略［J］。 植物保護， 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