胰蛋白酶（EC.3.4.4.4）特性及測定方法（試劑盒代測）

胰蛋白酶Trypsin （Parenzyme） 為蛋白酶的一種，EC 3。4。4。4，是從牛、羊、豬的胰臟提取的一種絲氨酸蛋白水解酶。在脊椎動物中，作為消化酶而起作用。在胰臟是胰蛋白酶的前體胰蛋白酶原被合成後，作為胰液的成分而分泌，受腸激酶，或胰蛋白酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側切斷。它不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強的蛋白酶，在決定蛋白質的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。

一、概 況

1。反應式

胰蛋白酶能水解多肽、醯胺、酯類等化合物，即作用於這些化合物中含有L-精氨酸或L-賴氨酸的羧基所構成的鍵。此酶反應的最適pH值約為7。8~8。5。

2。米氏常數

3。專一性

胰蛋白酶作用一些底物的反應性按此順序遞增，即多肽>醯胺類>酯類。此酶對於未變性的蛋白作用較慢。間-羥基苯酸酯與脂肪酯類亦可被胰蛋白酶水解。經變性的蛋白，諸如血紅蛋白與酪蛋白能被此酶作用。

4。啟用劑與抑制劑

Ca2+能提高此酶的活性，這是由於Ca2+離子可增加此酶的穩定性緣故。作為此酶的抑制劑有：有機磷化合物，胰臟中的天然多肽，大豆，利馬豆以及卵蛋白（通稱為胰蛋白酶抑制劑），此外，尚有苯醯-4-胍基-苯甲酸酯與 4-硝基苯醯-4-胍基苯甲酸酯。

5。穩定性

將此酶儲存在pH2。3~3的溶液中，可穩定達幾天時間，若以乾粉狀態儲存在5℃下，則可穩定幾個月之久。

6。意義

胰蛋白酶原經腸激酶作用，可轉變成胰蛋白酶。測定血清制胰蛋白酶頗有困難，因為血清含有抗胰蛋白酶的因子。患急性勝腺炎與患胰腺瘤的病人，發現抗胰蛋白酶因子大大地增加。

測定十二指腸液中此酶活性水平，是診斷膽囊纖維變性疾制的理想指標。

二、測定方法

1。分光光度法

胰蛋白酶的活性可用變性的血紅蛋白與酪蛋白加以測定。首先，加鹼性的脲使蛋白變性，爾後，胰蛋白酶即可水解易溶於三氯醋酸的蛋白成份，因此，產生的酪氮酸與色氮酸含量可用 Folin與CiocaIteu二氏方法加以測定，或者在280nm處測量吸光率的變化值。前一種方法變化係數為3。5%；後一種方法變異係數為6%。已知的各種物質皆無干擾作用。

已採用的底物有N-對-甲基磺醯-L-精氨酸甲酯、N-苯醯-DL-精氨酸-B-萘醯胺、N-苯醯-DL-精氨酸-對-硝基醯替苯胺以及N-苯醯L-精氨酸乙酯，可按分光光度法跟蹤胰蛋白酶水解速度。

還可以採用胰蛋白酶催化水解N-苯甲醯-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽（BAEE）的酯鍵，生成N-苯甲醯-L-精氨酸（BA），BA在253nm處有吸收峰，透過測定 253nm 吸光度增加速率，即可計算出胰蛋白酶的活性。

2。熒光法

有文獻曾介紹以苯醯-精氨酸-β-萘胺為底物測定胰蛋白酶。在此研究工作中，使用比色法測量由胰蛋白酶活性所產生的萘胺。使用這種底物發展了一種測定胰蛋白酶的高靈敏的熒光法。所測定的胰蛋白酶活性比較簡單的表示方法是：相對於以1微克的結晶酶活性進行比較，亦可用動力學方法經保溫1~5分鐘即可測定出此酶活性。此法可測定極其微量的酶活性。熒光法是在激發波長為338nm與發射波長為410nm處進行測定的。

胰蛋白酶的酶解活性可用對-甲苯磺醯精氨酸甲酯鹽酸鹽（TAME）作底物進行測定，釋放出的甲可藉助各種方法來測定。

有文獻採用熒光法測定酶促生成的甲醇，即將甲醇氧化為甲醛，進而使甲醛與乙醯丙酮聚合反應，然後與氨反應生成熒光團，此方法可測定出僅僅100微克的胰蛋白酶，因而，可用來測定血清中胰蛋白酶活性。雖然，此底物並非是胰蛋白酶專一的底物，亦可被溶纖酶（plasmin）與凝血酶水解，但是透過對此反應體系中加入或不加胰蛋白酶抑制劑可對胰蛋白酶進行特效性測定。

介紹了一種測定胰蛋白酶的熒光法，系採用苯醯 L-精氨酸-β-萘醯胺作底物。據報道該方法既反應簡便，且更靈敏。