液相色譜從頭學：檢測靈敏度和選擇性（二）

接上文

3.2.2.1流動相吸收值與其組分的關係流動相(不含樣品時)

在測定波長處的透光率必須足夠大。當到達測測器光電管的光強度下降時，基線噪音增加，檢測靈敏度降低。有研究表明，當流動相的

A>0。7

時，基線噪音會顯著增加

。該結果意指在所用檢測波長處，流動相的吸收值通常應小於

0。5

。當流動相的吸收值

A

超過

1。0

時，檢測器狀態可能已不適用。

表

3-2

中列出了反相

HPLC

用到的多種溶劑和新增劑的吸收值與波長，水在

180nm

以上實際無吸收，所以可忽略該流動相組分的影響。再者考慮在

200nm

處（

A<0。5）

可用於檢測的溶劑和新增劑，表

3-3

所示為在

200nm

或以上能用

UV

檢測的溶劑與水的典型溶液（無新增劑）。乙腈

-

水混合液以及其中含有表

3-3

中列出的限定濃度的新增劑時可在

200nm

或以上檢測。在

185-20onm

區域撿測受限更大。在

190nm

，

HPLC

級乙腈的

A=1。0

，所以乙腈在該流動相中的最大濃度為

50%

。能在

200nm

以下使用的、濃度在

1mM

以上的新增劑只有磷酸與脂肪胺。

正相色譜所用溶劑的吸收度通常更強，所以一般需在長波長檢測。表

3-4

列出一些溶劑在不同波長處的吸收值資料。注意

3-4

的溶劑和新增劑可能含有

UV

吸收雜質，或暴露在光線下和空氣中時，由於降解而產生吸收。因此，表

3-4

中的吸收值可能代表

HPLC

級溶劑的最大吸收值。如果溶劑的吸收值明顯比表

3-4

中的資料高，說明該物質可能已被汙染。

表3-3在≥220nm時，低背景吸收（＜0.5AU）的溶劑混合物

表3-4正相溶劑的UV吸收值與波長的關係

3.2.3 訊號、噪音與測定精度

採用

HPLC

進行定量分析時，精密的結果最為重要。檢測透過信噪比

（S/N）

影響檢測精度。響應訊號

（S）

為被測物峰的基線校正吸收值，而噪音

（N）

為基線的上下寬度。通常基線噪音有二種

：

由散射光和檢測器電子系統引起的短期噪音

（

高頻

）

和由溫度波動、泵

“

噪音

”

、和

/

或被汙染色譜柱引起的長期噪音。高頻噪音對於

0。1s

的響應時間（檢測器時間常數）較重要，而長期噪音對於

5s

的響應時間更重要。

3.2.4 提高信噪比，以獲得更好的檢測精度

當檢測精度隨被測物濃度變化時，增大

S/N‘

能得到更好的精密度。增大訊號

S

或降低噪音

N’

都可以使信噪比增加。選拌最大吸收值處的波長能得到最大訊號。由於噪音在

200nm

以上隨波長變化不大，所以波長最大值也就是

S/N‘

比值的最大值。而在

200nm

以下的波長處，噪音增加很快

（

尤其用舊氘燈

）

，於是波長最大值可能與最大

S/N’

比值處的波長不一致。能增大訊號的方式包括

：

增加被測物的濃度

C

0

增加進樣體積

V。

提高柱效

N

減小色譜柱體積

V。

減小被測物的保留值

K

減小噪音可能有幾種方式，這取決於高頻噪音還是長期噪音為主。兩種噪音對精度的影響也取決於資料處理與為特殊測定所選的積分引數。高頻噪音透過增加檢測器時間常數

t

或響應時間

（

響應時間

=2t）

可以除。同時，增加

t

的最終結果將使峰展寬和拖尾，也使訊號減小。如表

3-5

所示，當

t

從

0。1s

增加至

1。0s

時，噪音減小接近四倍，峰高未變。即高頻噪音減小很大而峰寬未受影胸。

t

增大至

4s

時，噪音從

3×10

-5

進一步減小至

2x10

-5

A

。由於增大時間常數使峰得以展寬，訊號

（

峰高或面積

）

也減小

6%

然而，

S/N

＇比也進一步增加至

T=2。0s

時的最大值

21。5

。繼續增大

t

將導致訊號降低，但噪音不再降，所以，

S/N

比值降低

（

如樣品分離度一樣

）

。

表3-5響應時間對檢測靈敏度的影響

泵脈動能產生長期噪音。這種噪音的特點是基線有規律地升高和下降，並平行於泵的迴圈時間。有些泵比其它泵產生脈動噪音的傾向大得多，但使用脈動阻尼器可顯著降低泵脈動的影響。當線上混合配製流動相時，兩種（或以上）混合溶劑的吸收值不同，由泵流出的流動相會使吸收值發生波動。其結果為基線週期性地上下波動，與泵脈動引起的現象類似，但與泵迴圈週期不向。消除這種與吸收值有關的噪音，可向線上混合的兩溶劑之一中加入不保留的

UV

吸收化合物，以使它們的吸收值相等。

另一種長期噪音由進樣前色譜柱的汙染造成，有些樣品中可能含有強保留化合物；幾種這樣的流出物（來源於以前不同的樣品，甚至經數次執行才能流出）重疊在一起，產生不規則基線。這種基線噪音在分析

“

髒

”

樣品（例如生物樣品、環保樣品如水或土壤提取物、有機反應混合物等）時常能見到，減少這種噪音有幾種方式：

HPLC

分析前將樣品處理於淨；用強溶劑清洗色譜柱；用保護柱；用梯度洗脫，或採用柱切換技術。透過除去樣品干擾物和／或將被測物濃縮的樣品預處理也能提高檢測精度。表

3-6

概括了提高檢測靈敏度（

S/N

比值）的系統方法。

表3-6加強UV檢測靈敏度的系統方法

3.2.5 檢測器的線性範圍

理想條件下，式

3。2

可適用於較寬的吸收值範圍，典型的

A

值上限至少為

1。0

。假設最小噪音為

2×10

-5

A

，因此可得到動力學範圍約為

2x10

4

。動力學範圍寬為

UV

檢測器廣泛應用的諸多原因之一。

3.2.6二極體陣列UV檢測器

二極體陣列檢測器

（DAD）

可以在一次執行中同時採集不同波長的色譜圖。執行結束後，能顯示任一所需波長的

（

通常為

190-400nm

之間

）

色譜圖。因此，

DAD

能夠比單一波長操作提供更多的樣品組成資訊。而且每個峰的

UV

光譜圖可作為最終

HPLC

方法選擇最佳波長的重要工具。最後，透過比較一個峰中不同位置的

UV

光譜，可以估計峰的純度。如果峰中僅有一種組分，色譜峰中不同位置的

UV

光譜應能疊加在一起。

一旦根據不同樣品峰的

UV

光譜，選定了較好波長，可用

DAD

檢查不同波長的色譜圖，以確證所選波長的優勢所在。在方法建立期間，

DAD

的應用對不同實驗之間含相同化合物的峰軌跡或峰匹配也很重要。