乳酸脫氫酶（LDH）特性及測定方法（提供檢測試劑盒）

乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LD 或LDH，EC1。1。1。27）是一類NAD依賴性激酶，有LDHA、LDHB、LDHC三種亞基，可構成6種四聚體同工酶。動物乳酸脫氫酶是由4個亞單位組成的四聚體，常見的A、B兩種亞基構成的5種LDH同工酶（LDH1-5），C亞基則僅組成一種LDH同工酶即LDH-C4。

乳酸脫氫酶為含鋅離子的金屬蛋白，分子量為135-140kD，是糖無氧酵解及糖異生的重要酶系之一，可催化丙酸與L-乳酸之間的還原與氧化反應，也可催化相關的α-酮酸。LDH廣泛存在於人體組織中，以腎臟含量最高，其次是心肌和骨肌。紅細胞內LDH約為正常血清的100倍。

一、概況

1。反應式

正向反應的最適pH值為8。8~9。8而逆向反應的最適pH值為7。4~7。9。

2。米氏常數

3。專一性

此酶對L（+）-乳酸作用是專一的，然而，對D（一）-乳酸卻毫無作用，它既不是底物，也不是抑制劑。B-氨基乳酸、B-滷代乙酸和甘油酸等物質被脫氫要比乳酸慢100倍，在逆向反應中，幾種a-酮酸能起氫化反應，其氫化速度隨鏈長度的增加而減慢。a-，γ-及二酮酸類的反應速度只有丙酮酸反應速度的十分之一。

此酶對於NADP與NADPH起反應僅為對NAD與NADH起反應速度的百分之一。

L-乳酸脫氫酶I型（H4）亦可稱為a-羥丁酸脫氫酶；因為全部LDH中有92%活性作用於a-羥丁酸的底物，而僅有極少量的此酶活性是作用於L-乳酸的。同樣地，LDH-1作用於a-酮丁酸比作用於丙酮酸底物活性更大。

4。啟用劑與抑制劑

LDH能被巰基試劑所抑制（如重金屬離子、碘、24-二硝基氟代苯、對-汞氯代苯甲酸等）；半胱氨酸或谷胱甘肽為可逆性抑制劑；硼酸、丙二酸、草酸、草氨酸以及EDTA則是競爭性抑制劑。

二甲基亞碸、二乙基已烯雌酚、乙醇以及甲醇對此酶皆具有穩定作用。

5。純度要求

所需的純度為每毫克蛋白應含500單位以上活性，而含醛縮酶與丙酮酸激酶（PK）的量應少於0。001%，含谷丙轉氨酶（GPT），L-蘋果酸脫氫酶（MDH）以及肌激酶（MK）的量應少於0。01%。

6。同工酶與意義

L-乳酸脫氫酶（LDH）是由四條肽鏈組成的二種型別的酶，即M型（存在於肝臟與肌肉中）以及H型（存在於心臟中），每一種酶是在單獨的遺傳控制下產生的。由於它們具有活性的四聚體的形式中所含的H與M單位的數目不同，因此，業已發現LDH具有五種同工酶。根據電泳分析，發現LDH-1型遷移最快，這種LDH-1型由四個單位（即H）組成。其次最快的是LDH-2即HM，隨後是LDH-3（HM2），LDH-4（HM），而LDH-5（M）移最慢。所謂肝臟中M型乳酸脫氫酶，主要來源於骨骼肌。

新近，已鑑別出LDH中含有第六種同工酶，即為LDH-C型同工酶，它在電泳圖譜上是位於LDH-3型與LDH-4型二區帶之間，此同工酶僅存在於青春期後的睪丸組織中。

不同來源的五種普通的同工酶現皆有市售供應。

人血清中LDH正常值範圍是：女性為40~120單位/升；男性為65~145單位/升。測定血清LDH對於多種疾病具有診斷價值。臨床證明，凡患有心肌梗塞症，肺梗塞症肝炎、充血性心力衰竭、白血病以及某些惡性腫瘤等疾病，此酶活性水平出現升高。患心肌梗塞症此酶活性水平較正常值高達10倍，但是，其它症狀通常僅比正常值升高5~6倍左右。患梗塞症後，在48~72小時內血清中此酶水平出現上升，並且這種活性上升能維持10~14天之久。因此，此酶臨床症狀頗象D-3-羥丁酸脫氫酶（HBDH），而不象肌酸激酶（CPK）與谷-草轉氨酶（GOT）。

患中毒性黃疸病與傳染性單核細胞增多症時，發現此酶水平較正常值增高18倍。患肝硬化症與梗阻性黃疸疾病時，此酶水平為正常情況的3~4倍。患有各種型別癌症的病人中，有 50% 患者出現LDH活性水平升高，而尤其是患異常癌症及肺癌病人表現出此酶水平特別高。未痊癒的惡性貧血症病人中，曾觀察到此酶水平較正常值升高10~80倍。

根據此酶的同工酶譜診斷疾病的性質乃是行之有效的。例如，患心肌梗塞症病人中，LDH-1與LDH-2活性水平比正常人血清高。患肝病時，LDH-4與LDH-5水平較正常人顯著地增高。

LDH亦可用來對谷丙轉氨酶（GPT）、肌酸激酶（CK）、二胺氧化酶（D-AOD）、肌激酶、磷酸甘油變位酶以及丙酮酸激酶（PK）進行偶聯反應測定。此外，尚可對5-二磷酸腺苷（ADP）、5‘-單磷酸腺苷（AMP）、丙酮酸、L-乳酸以及甘油進行酶法測定。

7。穩定性

將此結晶狀的酶懸浮在pH732M硫酸銨溶液中，於4℃下儲存，能穩定幾年時間。純化的酶在水溶液中卻是不太穩定的。若將此酶貯存在-20℃下，經一夜時間，LDH-4與LDH-5活性便喪失殆盡。將血清樣品貯存在25℃下，經2~3天時間，不會使酶活性出現明顯的喪失。將LDH-1置於65℃下尚能穩定30分鐘，但是，LDH-4與LDH-5置於57℃下，經30分鐘便失活了。

二、測定方法

1。分光度法

（1）逆向反應

LDH可用丙酮酸與NADH作底物進行測定，即於340nm處跟蹤NADH吸光率的減量。一個單位活性即定為：在標準條件下（溫度為25℃），每分鐘能引起1微克分子NADH氧化（初速度）所需的酶量。

一種比色法，即依據丙酮酸與2，4-二硝基苯肼反應而生成腙的原理，於440-450或525nm處測定腙的吸光率。

（2）正向反應

根據正向反應原理還推薦了另些測定方法，即在pH9~9。5條件下，用乳酸與NAD代替丙酮酸，特別是取代NADH，這是因為前兩種試劑更為穩定。每分鐘吸光率（340nm波長）增加的速度與LDH含量成正比。Morgenstern等已將此法用於自動化分析儀中，每小時可測定40個樣品。

在比色法中，由反應產物丙酮酸生成腙，即可於440或525nm處進行測定。

另一種採用甲基硫酸吩嗪（PMS）與四銼鹽染料的偶聯反應：

於500~550nm處測量髮色的甲脂吸光率，此法的變異係數為5%。

一種2-對-碘苯基-3-對-硝基酚-5-苯基氯代四銼鹽作為此反應中的四銼鹽染料。據稱此測定的靈敏度比NADH紫外測定法高三倍。只是在此測定中必須具備二種穩定的試劑。

可採用具有電子傳遞體作用的心肌黃酶來代替PMS試劑，於是，據此發展成測定血液中LDH的自動化分析法。

於505nm波長處透過流動比色池測量所生成的甲量。

另外，採用使亞銅（Cu+）生成新銅蛋白與反應產物NADH進行螯合反應，由此對LDH進行自動化測定：

依據455nm處測定此反應吸光率變化的原理，若設計在自動化分析儀系統中，每小時可測定 40個樣品。

2。熒光法

這些測定方法皆依據正向反應原理，NADH的熒光測定是相當靈敏、且方便的方法。基於如下反應式原理而對LDH 進行熒光法測定。

根據此法發展了一種自動化測定程式，系採用流動熒光比色池（使用7-60型原級濾光器，激發波長為365nmnm；2A/48 型次級濾光器，發射波長為460nm），每小時可測定60個樣品。

一種非液態試劑的半固體表面的熒光法測定LDH活性，這是依據測量正向反應過程中產生的NADH量將乳AD二種底矽膠墊的表面，這二種試劑在較長時間內能穩定；不過，當加入樣品之後，必須立刻開始測定。測定變異係數為2。3%，當LDH濃度範圍為160~1000單位/升時，此測定方法即成線性關係。所需的樣品僅10微升。

曾設計了一種簡便的超靈敏的熒光測定LDH方法，是根據使無熒光的刃天青染料轉化為有強烈熒光的試滷靈的原理（激發波長為540nm；發射波長為580nm），在此反應中採用PMS或心肌黃酶作為電子傳遞體：

由於試滷靈具有強烈的熒光（可檢測濃度為10-9M），因此，此法靈敏度較NADH測量法大大提高，對於10-1~10-4單位/毫升的LDH即可測出，其測定標準誤差僅為1%。

3。電化法

曾提出差示電流法測量血清中LDH。在正向反應過程中，所產生的NADH使賓斯舍德爾（Binschedler）氏綠染料發生還原反應。在外加0。56毫伏正電壓下，由兩個蠟封的管狀電極對照飽和甘汞電極來測量還原型染料被氧化的速度。

4。同工酶測定

透過無吸光性的DEAE-SephadexA-50凝膠載體使LDH-1和LDH-2與其它同工酶分離開，然後，按上述紫外分光法進行測定。這時，將含有LDH-1和LDH-2的凝膠載體離心分離，上清液中則含有LDH-3，LDH-4及LDH-5三種同工酶，用上述丙酮酸-NADH紫外法測定溶液中同工酶的活性（定為A2）。分離之前還應測定出樣品中LDH總活性（定為A1）。

此外，LDH的吸收百分率為：

測定變異係數約為6%。

所有五種同工酶的測定方法，首先採用瓊脂凝膠電泳法將這些同工酶分離開，然後，進行區帶顯影，即取另一條含L-乳酸，NAD，PMS以及四唑鹽的凝膠薄片進行顯影。用UF100型Vitatron光度計於546nm處對凝膠上酶活性區帶進行掃描檢測。

按照試劑盒測定方法，使用脲作指示劑，能使肝源型LDH與心源型LDH區別分開。肝源型 LDH能被脲強烈抑制，相反地，心源型LDH 卻能保持完全的活性。於是，透過加脲與不加脲的二次測定，則可測定出每種同工酶（LDH1+2與LDH3+4+5）所佔的百分率。