遺傳所開發出高精準胞嘧啶鹼基編輯工具

鹼基編輯技術是基於CRISPR系統開發的基因組定向修飾技術。該技術由於不需要DNA雙鏈斷裂和外源供體DNA可以實現對目的鹼基的精準替換，在疾病治療、植物性狀改良等方面具有很大的應用潛力。

不過，其脫靶效應仍是目前存在的一大難題。

近日，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞團隊透過對人類胞嘧啶脫氨酶（APOBEC3B）蛋白的理性設計，並結合新型的胞嘧啶鹼基編輯篩選方法，開發出了新型高精度，高編輯活性的胞嘧啶鹼基編輯工具。

北京時間2020年7月27日晚23時，相關論文線上發表於《分子細胞》。

高彩霞課題組長期致力於植物基因組編輯技術的創新及應用研究，前期已經在植物中建立了完善的胞嘧啶鹼基編輯器（Cytosine Base Editor， CBE）和腺嘌呤鹼基編輯器（Adenine Base Editor， ABE）技術體系，但是發現胞嘧啶鹼基編輯器存在脫靶效應。為解決這一問題，團隊展開進一步研究。

研究人員首先在水稻原生質體中建立並優化了基於R-loop的高通量鹼基編輯器特異性評估方法。

該方法利用CBE作用於單鏈DNA的特性，透過SpCas9的正交蛋白nSaCas9在編輯靶點外的基因組區段誘導R-loop，從而人為製造單鏈DNA（single stand DNA， ssDNA）區域。

如果CBE的脫氨活性在這些區域產生脫靶編輯，可以透過高通量測序進行富集檢測。

研究人員首先對已報道的5個胞嘧啶鹼基編輯器分別透過R-loop方法和全基因組測序 （Whole-genome sequencing， WGS）進行特異性檢測，發現R-loop方法與 WGS的結果一致，證明了R-loop方法的可靠性。且該方法與WGS相比，更加快速、便捷和經濟。

在此基礎上，研究人員透過對一系列理性設計的基於人源APOBEC脫氨酶的CBE的特異性進行篩選。

以編輯效率高且編輯視窗小的A3Bctd （a truncated APOBEC3B deaminase with enzymatic activity） 作為蛋白進化的原始底盤，根據蛋白結構資訊預測與其脫氨的催化活性和ssDNA結合能力相關的結構域以及這些結構域中的重要氨基酸殘基，透過理性設計獲得16個單氨基酸替換的CBE變體。

並透過篩選獲得了靶向效率維持較高且能較顯著降低脫靶效應的7種單個氨基酸突變 （R211K， T214V，， R311K， Y313F， D314R， D314H 和 Y315M）。

圖解：理性設計改造胞嘧啶脫氨酶APOBEC3B，篩選精準鹼基編輯器。上：根據APOBEC3B結構資訊理性設計並創制突變體。中：水稻原生質體中建立R-loop方法，高通量檢測CBEs變體特異性。下：利用全基因組測序，檢驗CBEs變體特異性。

為了進一步降低CBE的脫靶效應，研究人員將這些單氨基酸突變進行組合創制了9個多氨基酸替換變體，最終篩選得到了兩種靶向編輯效率較高且特異性顯著增加的CBE變體：A3Bctd-VHM-BE3 和A3Bctd-KKR-BE3。

對編輯產物的分析顯示，這兩種變體在編輯視窗內主要產生單個C或者兩個C的替換，顯著提升了編輯的精確性。

最後，透過對150個水稻編輯植株的全基因組測序資料進一步證明了A3Bctd-VHM-BE3 和A3Bctd-KKR-BE3的高特異性。

該工作結合基於結構資訊的蛋白理性設計、植物個體全基因組脫靶檢測技術和高通量R-loop脫靶檢測技術，進一步提高了單鹼基編輯的精確性，開發出的兩種能保持高編輯效率且無隨機脫靶效應的CBE變體，為基因治療和植物分子設計育種提供了強有力的工具支撐。（韓揚眉）

論文連結：

DOI：https：//doi。org/10。1016/j。molcel。2020。07。005

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