《自然》：AlphaFold和AI蛋白質摺疊革命終局如何

在過去的半年裡，AlphaFold狂熱席捲了生命科學領域。“我參加的每次會議，人們都在說‘為什麼不使用AlphaFold？’。”倫敦大學學院的計算生物學家Christine Orengo說。

當地時間4月13日，《Nature》發文總結了自AlphaFold出現以來，在生命科學領域產生了哪些令人矚目的成果，以及伴隨著AlphaFold的發展，又給生命科學帶來哪些新的可能性。最後，AlphaFold有何限制，其將去向何方？

以下為記者對《What‘s next for AlphaFold and the AI protein-folding revolution》原文的編譯：

在某些情況下，人工智慧節省了科學家的時間，甚至在一些情況下，它使以前不可想象或非常不切實際的研究成為可能。同時它也有侷限性，一些科學家發現它的預測對他們的工作來說太不可靠了。但實驗仍然如火如荼。

即使是開發AlphaFold的人也在努力跟上它在從藥物發現和蛋白質設計到複雜生命起源等領域的使用。“我醒來後在Twitter上輸入AlphaFold，”DeepMind的AlphaFold團隊負責人John Jumper說，“看到一切都有相當神奇之感。”

“AlphaFold改變了遊戲規則。”Baker說。“這就像一場地震。你可以在任何地方看到它，”以色列耶路撒冷希伯來大學的計算結構生物學家Ora Schueler-Furman說，他正在使用AlphaFold來模擬蛋白質相互作用。

AlphaFold在2020年12月引起了轟動，當時它主導了一場名為“蛋白質結構預測關鍵評估”（Critical Assessment of Protein Structure Prediction，CASP）的比賽。該競賽每兩年舉行一次，旨在衡量生物學最大挑戰之一的進展：僅從蛋白質的氨基酸序列中確定蛋白質的3D形狀。計算機軟體根據X射線晶體學或低溫電子顯微鏡（cryo-EM）等實驗方法，透過向蛋白質發射X射線或電子束以建立它們的影象形狀。

AlphaFold的2020版是該軟體的第二版。Jumper說，它還贏得了2018年的 CASP，但其早期的努力大多不足以代替實驗確定的結構，而AlphaFold2的預測平均而言與經驗結構已相當。

此前尚不清楚DeepMind何時會發布可廣泛使用的軟體，因此研究人員利用Jumper的公開演講中的資訊以及他們自己的見解，開發了自己的AI工具，稱為RoseTTAFold。

此後在2021年7月15日，描述RoseTTAFold和AlphaFold2的論文出現了，還有免費提供的開原始碼和專家執行他們自己工具版本所需的其他資訊。一週後，DeepMind宣佈它已經使用AlphaFold預測了人類製造的幾乎所有蛋白質的結構，以及其他20種廣泛研究的生物體的整個“蛋白質組”，例如小鼠和大腸桿菌數量超過36。5萬的總結構。DeepMind還將這些資訊公開發布到由EMBL的歐洲生物資訊學研究所維護的資料庫中（EMBL-EBI）。此後，該資料庫已增長至近一百萬個結構。

今年，DeepMind計劃釋出總計超過1億個結構預測。這幾乎是所有已知蛋白質的一半，是蛋白質資料庫 （PDB）結構庫中實驗確定的蛋白質數量的數百倍。

AlphaFold部署了深度學習神經網路（一種受大腦神經線路啟發的計算架構，可識別資料中的模式），它目前已經接受了蛋白質資料庫和其他資料庫中數十萬個實驗確定的蛋白質結構和序列的訓練。當面對一個新序列時，它將首先在資料庫中尋找相關序列，這些序列可以識別出傾向於一起進化的氨基酸，表明它們在3D空間中很接近。而現有相關蛋白質的結構可以提供另一種估計新序列中氨基酸對之間距離的方法。

AlphaFold在嘗試對氨基酸的3D位置進行建模時來回迭代來自這些平行軌跡的線索，並不斷更新其估計值。專家表示，該軟體在機器學習研究中的新思想應用似乎是AlphaFold如此出色的原因——特別是，它使用一種稱為“注意力”（attention）的人工智慧機制來確定哪些氨基酸連線在任何時候對其任務最重要。

該網路對相關蛋白質序列資訊的依賴意味著AlphaFold存在一些侷限性。即它並非旨在預測突變（例如引起疾病的突變）對蛋白質形狀的影響，它也沒有被訓練來確定在其他相互作用的蛋白質或藥物等分子存在的情況下蛋白質如何改變形狀。但它的模型附帶的分數可以衡量網路對其預測蛋白質每個氨基酸單元的信心，研究人員正在調整AlphaFold的程式碼以擴充套件其功能。

據DeepMind稱，到目前為止，已有超過40萬人使用了EMBL-EBI的AlphaFold資料庫。

用AlphaFold求解蛋白質結構

AlphaFold解析結構的能力已經給生物學家留下了深刻的印象。“根據我目前所見，我非常信任AlphaFold。”丹麥奧胡斯大學（Aarhus University）的結構生物學家Thomas Boesen說。該軟體已成功預測了Boesen中心已確定但尚未發表的蛋白質形狀，“這對我來說是一個很大的驗證。”

Boesen和奧胡斯微生物生態學家Tina antl-Temkiv正在使用AlphaFold來模擬促進冰形成的細菌蛋白質結構——這可能有助於雲中冰的冷卻效應。

斯德哥爾摩大學的蛋白質生物資訊學家Arne Elofsson說，只要一種蛋白質捲曲成一個明確定義的3D形狀，而且不需要全部如此，AlphaFold的預測就很難被擊敗。“這是一種一鍵式解決方案，可能是你將獲得的最佳模型。”

Elofsson說，在AlphaFold不太自信的地方，“它非常擅長告訴你什麼時候它不起作用”。在這種情況下，預測的結構可能類似於浮動的義大利麵條線（如下圖）。這通常對應於缺乏確定形狀的蛋白質區域，這種本質上無序的區域——約佔人類蛋白質組的三分之一，可能只有在存在另一種分子（如訊號夥伴）時才能得到很好的定義。

倫敦癌症研究所的計算生物學家Norman Davey表示，AlphaFold識別疾病的能力已經改變了他研究這些區域特性的工作，“我們的預測質量立即有了巨大的提高，而我們沒有付出任何努力。”

AlphaFold轉儲到EMBL-EBI資料庫中的蛋白質結構資料也立即投入使用。Orengo的團隊正在搜尋它以識別新的蛋白質種類（沒有透過實驗驗證它們），並且已經發現了數百甚至數千個潛在的新蛋白質家族，擴大了科學家對蛋白質外觀和功能的瞭解。

在另一項努力中，該團隊正在搜尋從海洋和廢水中採集的DNA序列資料庫，以嘗試識別新的食用塑膠酶。使用AlphaFold快速模擬近似的數千種蛋白質的結構，研究人員希望更好地瞭解酶如何進化以分解塑膠，並有何潛在改進可能。

“對於進化研究來說，將任何蛋白質編碼基因序列轉化為可靠結構的能力是特別重要的。”哈佛大學的進化生物學家Sergey Ovchinnikov認為，研究人員透過比較基因序列以確定生物及其基因在物種間的相關性。但對於遠緣相關的基因，比較可能無法找到進化親屬，因為序列發生了很大變化。那麼透過比較蛋白質結構——其變化往往不如基因序列快——研究人員或許能夠發現被忽視的古老關係。“這為研究蛋白質進化和生命起源提供了一個絕佳的機會。”蘇黎世瑞士聯邦理工學院的計算生物學家Pedro Beltrao表示。

為了驗證這個想法，首爾國立大學的計算生物學家Martin Steinegger和他的同事領導的一個團隊使用他們開發的“Foldseek”工具來尋找SARS-CoV-2的RNA複製酶的親屬（一種導致COVID-19的病毒）。在EMBL-EBI的AlphaFold資料庫中，這項搜尋發現了以前未知的可能遠古親屬：真核生物中的蛋白質，包括粘菌，它們的3D結構類似於稱為逆轉錄酶的酶。病毒如HIV使用逆轉錄酶將RNA複製到DNA中，儘管在遺傳基因序列水平幾乎沒有相似性。

作為實驗助理的AlphaFold

對於想要確定特定蛋白質的詳細結構的科學家來說，用AlphaFold預測不一定是直接解決方案。比起這個，它能提供的是一個可以透過實驗驗證或改進的初始近似值，這本身有助於理解實驗資料。例如，來自X射線晶體學的原始資料顯示為衍射X射線的圖案，科學家通常需要對蛋白質結構進行初步猜測才能解釋這些模式。

“以前，他們經常將來自蛋白質資料庫中相關蛋白質的資訊拼湊起來或使用實驗方法。”英國劍橋大學的結構生物學家Randy Read說，他的實驗室專門研究其中一些方法。現在，AlphaFold的預測使得大多數X射線模式不需要這種方法。Read說，他的實驗室正在努力在實驗模型中更好地利用AlphaFold，“我們完全重新調整了研究重點。”

Read和其他研究人員已經使用AlphaFold從X射線資料中確定晶體結構，這些資料在沒有足夠的起始模型的情況下是無法解釋的。“人們正在解決多年來一直沒有解決的結構。”Read實驗室的前博士後Claudia Millán Nebot說。她預計會看到大量新的蛋白質結構提交給蛋白質資料庫，“這在很大程度上是因為AlphaFold”。

專門從事冷凍電鏡研究（捕捉快速冷凍蛋白質的照片）的實驗室也是如此。在某些情況下，AlphaFold的模型準確地預測了稱為G蛋白偶聯受體（GPCR）的蛋白質獨特特徵，這些蛋白質是重要的藥物靶標。“它似乎非常適合生成第一個模型，然後我們用一些實驗資料對其進行改進，”北卡羅來納大學教堂山分校的結構生物學家和藥理學家Bryan Roth說，“這為我們節省了一些時間。”

但AlphaFold並不總是那麼準確，Roth補充說，在他的實驗室已經解決但尚未發表的幾十個GPCR結構中，“大約有一半的時間，AlphaFold結構相當好，而有一半的時間它們或多或少對我們的目的毫無用處。在某些情況下，AlphaFold以高置信度標記預測，但實驗結構表明它是錯誤的。即使軟體做對了，它也無法模擬蛋白質與藥物或其他小分子（配體）結合時的外觀，這會大大改變結構。”這樣的警告讓Roth想知道AlphaFold對藥物發現有多大用處。

在藥物發現工作中越來越普遍使用計算對接軟體（computational-docking software）來篩選數十億個小分子以找到一些可能與蛋白質結合的小分子（這表明它們可以製造有用的藥物）。Roth現在正與加州大學舊金山分校的藥物化學家Brian Shoichet合作，以瞭解AlphaFold的預測與透過實驗確定的結構相比如何。

Shoichet說，他們正將工作限制在AlphaFold的預測與實驗結構相吻合的蛋白質上。但即使在這些情況下，對接軟體也會為實驗結構和AlphaFold提供不同的藥物命中率，這表明微小的差異可能很重要。“這並不意味著我們不會找到新的配體，我們只會找到不同的配體。”Shoichet說。他的團隊現在正在合成使用AlphaFold結構鑑定的潛在藥物，並在實驗室中測試它們的活性。

AlphaFold可以幫助藥物發現？學者：帶著批判性的樂觀

Shoichet說，製藥公司和生物技術公司的研究人員對AlphaFold幫助藥物發現的潛力感到興奮。“批判性的樂觀就是我的描述。”2021年11月，DeepMind推出了自己的衍生產品IsoMorphic Labs，旨在將AlphaFold和其他AI工具應用於藥物發現，但該公司對其具體計劃隻字未提。

Karen Akinsanya領導著Schrdinger的治療開發，Schrdinger是一家總部位於紐約市的藥物發現公司，該公司也釋出化學模擬軟體。Akinsanya說，她和同事已經在虛擬螢幕和候選藥物的化合物設計中成功地使用AlphaFold結構，包括G蛋白偶聯受體（GPCR）。她發現，就像實驗結構一樣，需要額外的軟體來獲取氨基酸側鏈或單個氫原子可能所在位置的詳細資訊。一旦完成，AlphaFold結構已被證明在某些情況下足以指導藥物發現。

“很難說‘這是靈丹妙藥’；因為它可以令人驚訝的為一個結構做得很好，但它顯然不是非常適用於所有結構。”Akinsanya說。她和同事發現，AlphaFold的準確度預測並不能顯示一個結構是否對以後的藥物篩選有用。Akinsanya認為，AlphaFold結構永遠不會完全取代藥物發現中的實驗性結構，但他們可能會透過補充實驗方法來加速這一過程。

對AlphaFold感到好奇的藥物開發商在1月份收到了好訊息，當時DeepMind取消了對其用於商業應用的關鍵限制。當該公司在2021年7月釋出AlphaFold的程式碼時，它規定執行AlphaFold神經網路所需的引數或權重。這是在數十萬個蛋白質結構和序列上訓練的最終結果，僅用於非商業用途。Akinsanya表示，這對行業中的一些人來說是一個瓶頸，當DeepMind改變策略時出現了一股“興奮的浪潮”。（RoseTTAFold也有類似的限制，其開發人員之一Ovchinnikov說，但下一個版本將完全開源。）

人工智慧工具不僅改變了科學家確定蛋白質外觀的方式，一些研究人員正在使用它們來製造全新的蛋白質。“深度學習正在徹底改變我們小組中蛋白質設計的方式。”華盛頓大學的生物化學家、蛋白質設計和預測其結構領域的領導者David Baker說。Baker的團隊與計算化學家Minkyung Baek一起領導了開發RoseTTAFold的工作。

Baker的團隊讓AlphaFold和RoseTTAFold能夠產生新蛋白質“幻覺”。研究人員已經改變了人工智慧程式碼，因此，給定氨基酸的隨機序列，軟體將對其進行最佳化，直到它們類似於神經網路識別為蛋白質的東西。

2021年12月，Baker和他的同事報告說，在細菌中表達了129種這些幻覺蛋白，並發現其中約五分之一折疊成類似於其預測形狀的東西。“這確實是第一次證明你可以使用這些網路設計蛋白質。”Baker說。他的團隊現在正在使用這種方法來設計做有用事情的蛋白質，例如催化特定的化學反應，方法是指定負責所需功能的氨基酸，並讓AI“夢想”其餘部分。

蛋白質“幻覺”的四個例子。在每種情況下，AlphaFold都會顯示一個隨機氨基酸序列，預測結構並更改序列，直到軟體有把握地預測它將摺疊成具有明確3D形狀的蛋白質。顏色顯示預測置信度（從紅色表示非常低的置信度，透過黃色和淺藍色到深藍色表示非常高的置信度）。

破解AlphaFold：其工作原理如何？

當DeepMind釋出其AlphaFold程式碼後，Ovchinnikov想要更好地瞭解該工具的工作原理。幾天之內，他和包括Steinegger在內的計算生物學同事建立了一個名為ColabFold的網站，允許任何人向AlphaFold或RoseTTAFold提交蛋白質序列並獲得結構預測。Ovchinnikov設想他和其他科學家會使用ColabFold來嘗試“破解”AlphaFold，例如，透過提供有關目標蛋白質序列進化親屬的虛假資訊，Ovchinnikov希望他能夠確定網路是如何學會如此出色地預測結構。

事實證明，大多數使用ColabFold的研究人員只是想獲得蛋白質結構。也有其他人將其用作修改AlphaFold的輸入以處理新應用程式的平臺。“我沒想到會有各種型別的駭客攻擊。”Jumper說。

到目前為止，最流行的駭客攻擊是在蛋白質複合物上使用該工具，該複合物由多個相互作用的（通常是相互交織的）肽鏈組成。就像核孔複合物一樣，細胞中的許多蛋白質在與多個蛋白質亞基形成複合物時發揮作用。

AlphaFold旨在預測單個肽鏈的形狀，其訓練完全由此類蛋白質組成。但該網路似乎已經瞭解了一些關於複合物如何摺疊在一起的知識。AlphaFold的程式碼釋出幾天後，東京大學的蛋白質生物資訊學家Yoshitaka Moriwaki在推特上表示，如果將兩個蛋白質序列與長連線序列縫合在一起，它可以準確預測它們之間的相互作用。Baek很快分享了另一個從開發RoseTTAFold中收集到的預測複合物的技巧。

ColabFold後來加入了預測複合物的能力。同時，在2021年10月，DeepMind釋出了一個名為AlphaFold-Multimer 8的更新，與其前身不同，該更新專門針對蛋白質複合物進行訓練。Jumper的團隊將其應用於蛋白質資料庫中的數千個複合物，發現它預測了大約70%的已知蛋白質間相互作用。

這些工具已經在幫助研究人員發現潛在的新蛋白質夥伴。Elofsson的團隊使用AlphaFold預測了6。5萬個人類蛋白質對的結構，根據實驗資料這些蛋白質對被懷疑有相互作用。Baker領導的一個團隊使用AlphaFold和RoseTTAFold來模擬酵母編碼的幾乎每對蛋白質之間的相互作用，識別出100多個以前未知的複合物。

Elofsson說，這只是起點，他們在預測某些蛋白質配對方面做得很好，特別是那些穩定的，但很難識別出更短暫的相互作用。“因為它看起來不錯並不意味著它是正確的，”Elofsson說，“你需要一些實驗資料來證明你是對的。”

Kosinski認為，核孔複合體的工作是預測和實驗資料如何協同工作的一個很好的例子，“這並不是說我們將所有30種蛋白質都放入AlphaFold中，然後把結構拿出來。”為了將預測的蛋白質結構放在一起，研究小組使用了核孔複合物的3D影象，這些影象是使用一種稱為低溫電子斷層掃描的冷凍電子顯微鏡拍攝的。在一個例子中，可以確定蛋白質接近度的實驗在複合物的兩個成分之間產生了令人驚訝的相互作用，AlphaFold的模型隨後證實了這一點。

AlphaFold的限制：預測蛋白質新突變的後果

對於AlphaFold取得的所有進展，科學家們表示，重要的是要清楚它的侷限性，特別是因為不專門預測蛋白質結構的研究人員也在使用它。

嘗試將AlphaFold應用於破壞蛋白質自然結構的各種突變，包括與早期乳腺癌相關的突變，已被證實該軟體無法預測蛋白質新突變的後果，因為沒有進化相關的序列可供檢查。

AlphaFold團隊現在正在考慮如何設計神經網路來處理新的突變。Jumper預計這將需要網路更好地預測蛋白質如何從展開狀態變為摺疊狀態。哥倫比亞大學計算生物學家Mohammed AlQuraishi說，這可能需要僅依靠它所學到的蛋白質物理學知識即可預測結構的軟體。“我們感興趣的是，在不使用進化資訊的情況下從單個序列進行預測，”他說，“這是一個關鍵問題，但仍然懸而未決。”

AlphaFold還旨在預測單個結構。但是許多蛋白質具有多種構象，這對其功能可能很重要。“AlphaFold不能真正處理可以採用不同構象的不同結構的蛋白質。”Schueler-Furman說。預測是針對孤立結構的，而許多蛋白質與配體（如DNA和RNA）、脂肪分子和礦物質（如鐵）一起發揮作用。“我們仍然缺少配體，我們缺少關於蛋白質的其他一切。”Elofsson說。

AlQuraishi認為，開發這些下一代神經網路將是一個巨大的挑戰。AlphaFold依賴於數十年的研究，這些研究產生了網路可以學習的蛋白質實驗結構。目前無法獲得如此大量的資料來捕捉蛋白質動力學，或者蛋白質可以與之相互作用的數萬億個小分子的形狀。Jumper補充說，蛋白質資料庫包括蛋白質與其他分子相互作用時的結構，但這僅捕獲了一小部分化學多樣性。

研究人員認為，他們需要時間來確定如何最好地使用AlphaFold和相關的人工智慧工具。AlQuraishi看到了電視發展早期的相似之處，當時一些節目由廣播電臺組成，只是閱讀新聞，“我認為我們將找到我們尚未設想的結構的新應用。”

AlphaFold革命的終點在哪裡，誰也說不準。“事情變化太快了，”Baker說，“即使是下一年，我們也將看到使用這些工具取得的重大突破。”EMBL-EBI的計算生物學家Janet Thornton認為，AlphaFold的最大影響之一可能只是說服生物學家對計算和理論方法的見解更加開放，“對我而言，革命就是思維方式的改變”。

AlphaFold革命激發了Kosinski的遠大夢想，他認為受AlphaFold啟發的工具不僅可用於對單個蛋白質和複合物進行建模，還可以對整個細胞器甚至細胞進行建模，直至單個蛋白質分子的水平，“這是我們未來幾十年的夢想。”

（本文來自澎湃新聞，更多原創資訊請下載“澎湃新聞”APP）