提高細胞計數準確度的tips

許多生物科學包括單細胞測序技術的應用，都需要精準地測量細胞數量和存活率，然後再進行下游分析。可以採用傳統的血球計數儀和顯微鏡進行手動評估或者採用自動細胞計數儀自動計數，不論選擇何種細胞計數平臺，對單一樣本進行重複計數或計數多個樣本時獲得精準的計數值至關重要，但有時也面臨諸多挑戰。

單細胞測序技術（single cell sequencing）是指在單個細胞水平上，對基因組、轉錄組、表觀組進行高通量測序分析的一項新技術，它能夠彌補傳統高通量測序的侷限性，揭示單個細胞的基因結構和基因表達狀態，反映細胞間的異質性。因此過高或低估細胞濃度、小細胞或細胞碎片的殘留、高結團率等因素都會對其下游實驗結果有著關鍵影響。

本文針對10x單細胞測序平臺列出了實現精準的細胞計數關鍵要素，以此為參照即可最大程度地降低差異，使細胞計數結果的可信度最大化。

一、樣本室表面潔淨

上樣的樣本室要擦拭乾淨，或細胞計數板要保持表面潔淨。任何汙染都可能導致不準確的結果。對於手動細胞計數，這涉及到移除和清潔蓋玻片，並用70%的乙醇和水清洗計數室。當使用一次性塑膠載玻片時，每個樣品需要一個新的載玻片（如果載玻片有兩個腔室，則需要一對樣品）。

二、樣本製備

如何製備目的細胞對手動和自動細胞計數的影響極大。應保持樣本均勻性，方能確定計數差異是由實驗處理還是樣本製備條件引起的。

下面是樣本製備的一些小技巧，可以提高您的計數準確度和精度。

標準化細胞操作步驟

在很多情況下，應比較來源於不同的培養瓶或培養板中的多個樣本的細胞存活率和濃度。必須認識到細胞操作步驟的微小差異 （包括水解、移液或離心步驟） 會對不同樣本的總細胞計數和存活率產生極大的影響。

確保細胞懸液混合均勻。

利用短暫且溫和的渦旋振盪方法或手動攪拌試管——有時被稱為“手指輕彈”技巧——可以製備均勻的懸液。將細胞置於實驗臺上放置一會然後移液，會導致細胞沉至管底，形成人為的濃度梯度，存在出錯的可能性。細胞樣本靜置時間越長，濃度梯度越大，從而提高了差異性。為使移液差異最小化，應按照上述方法混合樣本，然後從試管中間而不是試管底部 （底部可能形成人為的高濃度細胞）移液。

儘可能減少碎片。

不論選擇何種計數或染色方法，含有大量碎片的樣本都難以進行計數和存活率評估。碎片的數量因細胞型別、培養條件、製備方案和使用的試劑不同而異。考慮碎片可能的形成原因並採用措施儘可能地減少碎片，可以提升細細胞計數需要對整個原液的一個小樣本進行分析，因此必須小心確保該樣本是原始原液培養的代表。胞計數和存活率結果的準確性。

最大程度地減少細胞樣本碎片的常見技巧：

在使用前離心臺盼藍

使用新鮮配製的染色試劑 （臺盼藍、NucBlue™ Live、碘化丙啶等）

使用經過過濾除菌的培養基和緩衝液

根據需要的時間間隔傳代細胞

減少細胞結團

細胞計數需要對整個原液的一個小樣本進行分析，因此必須小心確保該樣本是原始原液培養的代表。雖然自動細胞計數儀能夠應用演算法來識別塊內的細胞，但它們無法糾正非代表性樣本。當手動計數時，團塊的評分比單個細胞更具主觀性，增加了使用者與使用者之間的可變性。細胞裂解後的細胞外DNA和細胞碎片是凝塊形成的常見原因。細胞裂解可能是由於過度生長、透過過多的管道輸送或凍融迴圈進行的機械剪下，以及胰蛋白酶消化不足或過度等因素造成的，這些因素也可能導致樣本的不均勻。透過避免細胞裂解的原因和過濾細胞碎片樣品，可以減少細胞團塊。

三、正確調整聚焦

無論是手動計數還是依靠軟體演算法，重要的是要調整焦距和曝光設定，以確保單元格的最佳可見性，從而獲得最精確的結果。最佳聚焦和曝光將顯示細胞膜和背景之間的強烈對比。

A。 聚焦：在最佳聚焦下，活細胞的膜將在明亮的白色中心周圍形成一個黑色的環；

B。 曝光：調整曝光，使強度最大，而不允許訊號超出細胞邊界。在調整過程中，可在亮場和熒光通道之間切換。在明場視野下，熒光訊號的直徑不應大於細胞邊界。使用雙熒光通道時，每個通道的曝光應單獨設定。

四、適當調整引數與閾值

光強度

無論是臺盼藍或是熒光染色，都都必須使背景 （如噪聲） 最小化同時使訊號最大化，這樣可以提高靈敏度並最大程度地提高信噪比。實現上述目標的要求之一是透過調整光源正確設定光強度。

細胞圓度、大小、亮度等

大多數自動細胞計數儀都包括可調整的引數設定，以最佳匹配研究中的細胞。例如，可以設定和儲存細胞大小範圍，以便從分析中排除碎片或其他細胞種群。也可以使用設定來定義細胞形狀，可以在細胞計數之前或之後調整設定，並根據新的引數重新分析資料。

圓度：在大多數情況下，碎片的形狀不規則，採用臺酚藍染色呈暗色，在許多自動細胞計數儀 （包括Countess II自動細胞計數儀） 中使用圓度引數可以將其高效“排除”。

大小：根據大小進行明場設門通常應用於有多種細胞型別的應用 （如神經和幹細胞培養、血液樣本或有碎片存在時）。使用自動細胞計數儀，使用者可以輕鬆設門，在計數中包括或排除特定的細胞 （圖6）。採用Countess II自動細胞計數儀，必須注意，使用者可以針對活細胞和死細胞群體單獨設門，從而提高了靈活性。

亮度：根據熒光強度設門提高了設門策略的靈活性。在許多情況下，使用者只想知道多少細胞的訊號模糊以及明亮，或者表達熒光蛋白。圖7A顯示了表達GFP的樣本，包含兩種細胞群體——訊號模糊以及明亮；訊號模糊的細胞被排除，13%的計數細胞表達較強的GFP。在圖7B中，存在兩種熒光顏色，可透過結果介面的“更多”（More） 按鈕，根據大小、亮度、圓度和熒光強度單獨設門。Countess II FL可以儲存上述引數，以確保樣本間的一致性，供以後使用。

五、總結

造成細胞計數結果差異的原因有很多種。樣本製備、焦距設定、光強度設定和設門策略都會對結果產生影響。遵循這些提示將有助於提高細胞計數的準確性和再現性。

參考資料

1］ 實現精準細胞計數的四個關鍵要素。 Life

2］ 191-Seven-Tips-to-Improve-Cell-Counting-Accuracy。 Denovix

養細胞要用好血清！

文章來源於： 聯川生物

本文所用圖片及內容均來源於網路收集整理，僅供學習交流，版權歸原作者所有，並不代表我站觀點。本站將不承擔任何法律責任，如果有侵犯到您的權利，請及時聯絡我們刪除。