視網膜樣本的空間代謝組+蛋白組學延緩視網膜神經退行性病變研究

前言

神經退行性疾病

是由進行性神經細胞死亡引起的無法治癒的疾病。

色素性視網膜炎

（RP）是一種致盲性神經退行性疾病，可導致光感受器死亡甚至失去視網膜。透過

蛋白質組學和質譜成像技術（空間代謝組學）

研究，間接活檢視網膜，識別視網膜蛋白質組的變化可為保護視網膜提供理論依據。

2020年1月，美國斯坦福大學拜爾斯眼科研究所和愛荷華大學卡弗醫學院

Katherine J. Wert

和

Gabriel Velez

教授課題組在

EBioMedicine

（IF：8。143）發表了題為

“Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration”

的研究成果，透過

蛋白質組學、DESI-MSI空間代謝組學

和

LC-MS/MS

等多組學研究方法，發現代謝途徑和能量通路對視網膜神經的保護作用特徵，探究了補充代謝物保護視網膜機理，描繪了視網膜細胞通路中代謝物圖譜。為TCA迴圈和有氧代謝保護視網膜提供了理論依據。

研究思路

研究方法

1. 實驗分組

（1）實驗組：Pde6ɑ小鼠，食物中加入生酮、維生素B2和B3、ɑ-KG；飲用水中加入褪黑激素和白藜蘆醇

（2）對照組：C57BL/6J （B6）小鼠

2.技術路線

2。1AF/IR：獲取視網膜、視神經的影象

2。2免疫細胞化學：視網膜採用共焦顯微鏡成像

2。3

蛋白質組學

：玻璃體和視網膜樣品進行蛋白質提取和消化

2。4

LC-MS/MS

：分析SAX組分

2。5

DESI-MSI（空間代謝組學）

：SAM（微陣列顯著性分析）技術區分Pde6ɑ小鼠和ɑ-KG治療小鼠

2。6統計分析：S-t 檢驗、單因素方差分析、Tukey’s pos-hoc多重比

研究結果

蛋白質組學研究RP的神經視網膜變化

基因測試顯示PDE6A基因中存在p。R102C/p。S303C突變（圖1a）。與正常對照組相比（圖1b-d），眼底自體熒光（AF）顯示高密度中央AF環（圖1e-f），光學相干斷層掃描（OCT）顯示神經元細胞層變薄（圖1g）。此外，AF成像上顯示高自體熒光環（圖1h-i），OCT成像顯示視網膜細胞層變薄和黃斑囊樣水腫（圖1j）。

圖1 | 兩名常染色體隱性遺傳性視網膜色素變性患者攜帶PDE6A突變

手術時收集液體玻璃體活組織，由於兩名arRP患者接受了玻璃體切除術以去除ERM，因此將兩名無RP患者的ERM玻璃體樣本用作對照（圖2a-b）。採用

LC-MS/MS蛋白質組學

分析玻璃體樣品，以確定蛋白質組含量。透過人玻璃體

蛋白質組學

研究突出了RP疾病進展過程中神經視網膜的變化。

圖2 | PDE6A人玻璃體的蛋白質組學分析

蛋白質組學分析確臨床表型的蛋白表達改變

ERG分析，小鼠在一個月大時視杆光感受器視覺功能喪失，兩個月大時整體視覺功能完全喪失（圖3a）。Pde6ɑ小鼠出生後第14天組織學上可檢測到光感受器變性（圖3b）。採集患病小鼠的視網膜和玻璃體，並進行

LC-MS/MS蛋白組學分析

。隨著神經退行性變的發展，蛋白質表達減少、蛋白質的降解增加。透過野生型小鼠與Pde6ɑ小鼠玻璃體中的蛋白質對比，表明神經元細胞死亡是在早期階段。Pde6ɑ視網膜和玻璃體蛋白質組學分析確定了可能先於細胞丟失和RP臨床表型的整體蛋白表達的改變。

圖3 | 早期、中期和晚期視網膜色素變性（RP）患者Pde6ɑ視網膜和玻璃體的蛋白質組學分析

氧化代謝途徑在神經元細胞死亡開始時的Pde6ɑ視網膜

檢測神經元細胞死亡開始時的分化蛋白表達，使用單因素方差分析和分層熱圖聚類法比較PDE6ɑ（P15）和野生型小鼠的玻璃體和視網膜蛋白水平。與對照組相比，Pde6α中共有1067個蛋白差異表達D670G樣品。對照組視網膜中有446種蛋白在變性過程中缺失，並在病變的玻璃體Pde6ɑ中也被檢測到。表明在RP開始時，446種視網膜蛋白從健康視網膜中耗盡並釋放到玻璃體中（圖4）。

圖4 | Pde6ɑ視網膜和玻璃體的蛋白質組學分析確定整體蛋白表達變化

視網膜氧化代謝在早期視網膜變性中受到影響，表明視網膜神經網路可能對疾病期間發生的代謝途徑內的變化敏感。而早期的Pde6ɑ小鼠蛋白質組對候選生物標記物的驗證和鑑定表明了該治療方法的潛在靶向途徑（圖5）。

圖5 | 蛋白質組學的arRP代謝物補充方法

生酮飲食延緩arRP小鼠光感受器細胞丟失

生酮飲食治療arRP小鼠，透過外核層厚度的組織學分析，其感光細胞的存活率較低（圖6a）。透過與標準食物餵養的同窩小鼠相比，整體視覺反應有輕微的緩解（圖6b），而小鼠的ERG反應無顯著差異（圖6c-e）。

圖6 | 生酮飲食治療arRP臨床前小鼠光感受器細胞存活

口服補充單一代謝物可延長神經細胞存活和視力

Pde6ɑ小鼠的飲用水中提供α-酮戊二酸、維生素B3、維生素B2、褪黑素或白藜蘆醇，治療一個月後進行ERG視覺功能檢查。ERG描記顯示，小鼠的視杆光感受器、視杆-視錐光感受器ɑ波反應和全視網膜內暗視ERG均出現視覺改善情況（圖7），而補充褪黑素和白藜蘆醇後均未顯示出對視覺功能的影響（圖7b-d）。透過ɑ-KG治療後，感光細胞（ONL）及其內/外段在統計學上有顯著意義（圖7e-f）。評估GFAP免疫反應性的分佈，表明經過一段時間治療，補充ɑ-KG不會抑制疾病模型中的Muller膠質細胞啟用（圖7g）。

圖7 | 口服補充單一代謝物可改善arRP臨床前小鼠的光感受器細胞存活和視覺功能

視網膜組織切片的空間代謝物/脂質成像

為了研究Pde6α小鼠的脂質和代謝物分佈，選擇了35個新鮮冷凍組織樣本，並進行負離子模式解吸電噴霧電離質譜成像（DESI-MSI）

空間代謝組學

研究（圖8a）。組織DESI-MS影象質譜表示，確定了分子離子是與糖酵解、TCA迴圈、脂肪酸和磷脂相關的小代謝物（圖8b-d）有關。微陣列顯著性分析（SAM）確定了未治療Pde6α和α-KG治療小鼠之間377種差異表達的代謝物有關。雖然DESI-MSI

空間代謝組學

檢測到了α-KG，但Pde6α和α-KG治療組之間的差異有限（圖8）。

圖8 | 視網膜組織切片的DESI-MSI

SAM中差異分佈的代謝物表明，未經治療的Pde6α和α-KG治療組之間的幾種改變途徑與蛋白質組學研究結果一致。根據

DESI-MSI空間代謝組學

成像和SAM，與未治療狀態相比，治療狀態下的琥珀酸、烏頭酸、谷氨醯胺水平均升高，穀氨酸水平略有增加（圖9a-d）。DESI-MSI表明補充的α-KG增加了TCA代謝物水平，可能在細胞的抗氧化反應中發揮了一定的作用。

圖9 | DESI-MSI資料中野生型、arRP和α-KG治療小鼠的視網膜脂質和代謝物相對強度分佈

相關結論

蛋白質組學和DESI-MSI空間代謝組學

技術提供了關鍵途徑，而關鍵途徑內的代謝產物傳遞顯示出對神經系統的有效保護作用。

蛋白質組學

檢測到的OXPHOS和TCA迴圈關鍵代謝途徑是相關色素性視網膜炎（RP）治療的關鍵靶點，但也需要進一步研究此方法是否適用於RP或其他神經退行性疾病。

研究結論

透過液體活檢

蛋白質組學

和

DESI-MSI空間代謝組學方法

分析色素性視網膜炎（RP）程序中受影響的分子途徑靶點。透過口服補充迴圈代謝物，可保護神經，增強視覺功能，延緩感光細胞的喪失，對感光細胞和內視網膜均提供保護作用。

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