復旦表觀團隊揭示METTL3調控小鼠胚胎幹細胞異染色質形成機制

異染色質是什麼

責編 | 兮

mRNA上的m6A修飾受到了廣泛的關注，其對於mRNA的命運調控涉及其生物學功能的方方面面，包括剪接、轉運、降解、翻譯等，m6A主要由METTL3/METTL14複合物催化，目前的研究主要集中在METTL3/METTL14對於細胞質中mRNA的調控研究。但是METTL3是否參與以及如何參與調控染色質功能的研究相對較少。

內源性逆轉錄病毒

（Endogenous retrovirus，

ERVs

）元件是基因組轉座子元件之一，約佔小鼠基因組的10%，為了阻止這些轉座元件在基因組中四處移動造成遺傳突變，細胞進化出了相應的表觀遺傳修飾抑制這些轉座子的活性。

小鼠胚胎幹細胞主要透過H3K9me3和H4K20me3修飾抑制轉座子ERV的活性，但是否還有更多的表觀遺傳修飾參與其中的研究相對較少。

2021年1月27日，來自復旦大學生物醫學研究院的

沈宏傑

青年研究員和牛津大學Ludwig腫瘤研究所的

Yang Shi

教授合作在

Nature

雜誌線上發表了

Nature

的研究論文，

METTL3 regulates heterochromatin in mouse embryonic stem cells

（Endogenous retrovirus）

METTL3 regulates heterochromatin in mouse embryonic stem cells

（intracisternal A-particles，IAP）

該研究發現METTL3透過調控內源性逆轉錄病毒

為了探究METTL3在染色質上的功能，研究者首先透過ChIP-seq技術發現

IAPEz

，呈現很強的正相關性，進一步的分析發現METTL3主要結合在內源性逆轉錄病毒（Endogenous retrovirus）IAPEz轉座子亞群上。IAPEz轉座子主要透過H3K9me3和H4K20me3修飾來沉默，H3K9me3主要由甲基轉移酶複合物SETDB1/TRIM28複合物催化，H4K40me3則主要由SUV420H1/2催化，並且依賴於H3K9me3。

為了探究METTL3是否參與調控其結合位點上的H3K9me3/H4K20me3，研究者首先構建了

亞群上的異染色質狀態，進而抑制IAPEz元件轉錄。

敲除細胞以及METTL3WT和METTL3APPA酶活突變體回補細胞，並且發現

METTL3在小鼠胚胎幹細胞mESCs染色質的富集主要跟異染色質修飾H3K9me3和H4K20me3共定位

敲除以後METTL3結合位點的H3K9me3/H4K20me3水平顯著降低，並且這種降低可以被METTL3 WT回補，而不能被METTL3APPA回補，提示METTL3調控異染色質依賴於m6A修飾。同時研究者發現METTL3結合位點的H3K9me3修飾在去甲基化酶

Mettl3

敲除細胞裡上升，進一步支援m6A修飾正向調控H3K9me3修飾的假設。同時研究者發現

Mettl3

敲除以後，H3K9me3/H4K20me3修飾主要在METTL3結合的IAPEz降低，而其它轉座子元件上的H3K9me3/H4K20me3則基本不變，進一步提示

Alkbh5

。進一步的RNA-seq發現METTL3結合的IAPEz RNA在Mettl3敲除細胞中上升，並且這種上升可以透過METTL3WT回補，而不能透過METTL3APPA回補，並且Mettl3敲除以後的RNA上升也主要侷限在METTL3結合的IAPEz轉座子。

mRNA上的m6A修飾主要透過YTHDF1/2/3蛋白促進RNA降解，研究者為了探究降解途徑是否也參與IAPEz RNA的轉錄後修飾，研究者透過RNA半衰期實驗發現IAPEz RNA的半衰期在Mettl3 敲除以後並沒有顯著變化，而對照mRNA Nxt1的半衰期則顯著上升，提示

Mettl3

研究者進一步分析了公共資料庫的

METTL3透過結合染色質順式調控結合位點的異染色質修飾

敲除細胞的RNA-seq資料，也發現IAPEz RNA的含量不會隨著

METTL3調控IAPEz RNA含量主要透過轉錄調控，而不是轉錄後調控。

敲除而上升，進一步支援m6A修飾不是透過轉錄後調控來促進IAPEz的降解。

進一步，研究者發現METTL3結合IAPEz依賴於其酶活，在回補實驗中，只有METTL3WT可以結合染色質，而METTL3APPA，METTL3W475A和METTL3N477A等酶活突變體都不能結合染色質。同時，研究者發現METTL3複合物成分，

Ythdf1/2/3

，

Ythdf1/2/3

敲除或者

Mettl14

，

Rbm15/Rbm15B

，

Wtap

敲低以後，METTL3在染色質的結合都降低，進一步支援METTL3結合染色質依賴於其催化產物m6A的假設。

為了探究METTL3如何調控其結合位點的H3K9me3修飾，研究者發現METTL3可以和H3K9me3甲基轉移酶SETDB1及co-factor TRIM28（KAP1）相互作用，

Zc3h13

敲除以後，SETDB1和TRIM28在IAPEz上的富集也降低，提示METTL3透過招募SETDB1/TRIM28複合物來調控H3K9me3修飾，同時研究者發現METTL3與SETDB1/TRIM28的相互作用不依賴於METTL3的酶活。

基於METTL3結合IAPEz依賴於酶活，以及METTL3是一個RNA的m6A甲基轉移酶，研究者推測METTL3結合位點的順式轉錄本IAPEz RNA可能對於METTL3結合染色質至關重要。研究者發現一半左右的IAPEz RNA在染色質組分，同時用ChIRP-seq和分析已發表的GRID-seq資料發現IAPEz RNA可以順式結合在IAPEz 轉座子元件上。研究者透過MeRIP-seq實驗發現m6A修飾主要存在於 IAPEz RNA的5’UTR，這與METTL3更結合在IAPEz元件的5’UTR一致。考慮到IAPEz RNA含量較低，而IAPEz RNA含量在

Virilizer

敲除細胞可以大幅度上升，研究者在

Mettl3

敲除細胞中透過MeRIP-seq實驗發現了更多更強的m6A訊號，同時研究者用SELECT實驗進一步明確了可能發生m6A的位點。

透過篩選潛在的m6A識別子蛋白，研究者透過ChIP-qPCR發現YTHDC1也主要結合在IAPEz轉座子元件上，並且透過ChIP-Seq發現METTL3和YTHDC1在染色質上有很好的共定位。YTHDC1在染色質上的富集水平依賴於METTL3以及METTL3的酶活，提示YTHDC1結合染色質依賴於RNA的m6A修飾。考慮到YTHDC1對於小鼠胚胎幹細胞生長是必需的，研究者首先過表達了可降解的AID-YTHDC1，然後敲除內源的

Setdb1

或者突變得到失去m6A結合能力的YTHDC1W429A，透過快速降解外源的AID-YTHDC1蛋白，研究者發現YTHDC1W429A突變體在染色質的富集水平也會大幅度丟失，進一步支援YTHDC1結合染色質依賴於m6A修飾的假設。

由於METTL3結合染色質依賴於其m6A催化活性，研究者推測YTHDC1反過來促進METTL3在染色質上的結合，研究者發現METTL3在染色質上的富集在

Setdb1

敲除細胞或者YTHDC1W429A細胞中都顯著降低，同時伴隨著H3K9me3/H4K20me3修飾水平的降低和IAPEz RNA轉錄的上升。進一步研究者發現METTL3可以和YTHDC1相互作用，並且這種相互作用不依賴於METTL3的酶活。最後研究者發現

Ythdc1

研究者在文中還討論了YTH蛋白在裂殖酵母和哺乳細胞中調控異染色質的異同（下圖）。RNA參與異染色質形成的研究主要集中在裂殖酵母中，裂殖酵母細胞缺少m6A甲基催化酶METTL3同源物，因此YTH同源蛋白Mmi1不識別m6A修飾，而透過識別RNA上的DSR序列參與異染色質形成，而

Ythdc1

同時，研究者還在補充材料討論了5’UTR和3’UTR區域m6A修飾的區別，mRNA上的m6A修飾主要在3’UTR，並且透過YTHDF1/2/3蛋白促進mRNA降解。而IAPEz RNA上的m6A修飾主要在5’UTR區域，並且不促進YTHDF1/2/3參與的mRNA降解。另外m6A修飾也存在於熱激蛋白HSP70的mRNA 5’UTR，但是也不參與HSP70的降解，提示5’UTR和3’UTR可能參與不同的調控作用。

總之，

甲基催化酶SETDB1反過來也可以促進METTL3和YTHDC1在IAPEz轉座子元件的富集。

值得一提的是，一週前來自法國巴黎居里研究所的

哺乳細胞中YTH同源蛋白YTHDC1透過識別METTL3催化的m6A修飾參與異染色質形成。

和

這項工作發現METTL3可以結合小鼠胚胎幹細胞ERV中的IAPEz轉座子，透過招募SETDB1/TRIM28維持IAPEz轉座子上的異染色質狀態。

團隊在

Deborah Bourc’his

雜誌上合作發表了一篇題為

Tomasz Chelmicki

的文章，該研究揭示了m6A透過促進ERVs轉錄的mRNA降解，維護基因組穩定性的機制（Nature | RNA mA調控內源逆轉錄病毒的命運）。

復旦大學生物醫學研究院

Nature

博士是論文的第一作者，復旦大學生物醫學研究院的

Nature

和牛津大學Ludwig腫瘤研究所的

m6A RNA methylation regulates the fate of endogenous retroviruses

為論文的通訊作者，復旦大學生物醫學研究院的博士生

m6A RNA methylation regulates the fate of endogenous retroviruses

和

徐文綺

、

沈宏傑

、

Yang Shi

、

李佳慧

何晨曦

、

溫菁

，副研究員

榮博文

、

王立

勇

、

王嘉華

，同濟大學的

吳飛珍

，哈佛醫學院的

譚

參與了這項工作。

沈宏傑主要致力於表觀修飾的互作以及這些修飾在疾病和早期胚胎髮育中的作用，相關研究成果相繼發表在

理

（2016）、

刁建波

（2020a， 2020b）、

馬紅輝

（2021），熱誠歡迎有志於科學研究的博士後，研究生，本科生加入（聯絡郵箱：hongjieshen@fudan。edu。cn）。

Yujiang Geno Shi

Cell