賽業神經科學第五期：漸凍症的發病機理及相關小鼠模型概述

表型模擬是什麼意思

前文將肌萎縮性脊髓側索硬化症（漸凍症， ALS）的症狀和治療手段做了一個小小的總結，今天我們來聊一聊ALS的機理及相關的動物模型。在說機理之前，一個繞不開的話題就是運動神經系統及運動神經元，因為該疾病造成的損傷都是針對運動神經系統的，雖然肌肉也受到了影響，但只能算得上是“次生災害”。

漸凍症與運動神經系統

主動運動（Voluntary Movement）的訊號傳遞始於大腦中的運動皮層和腦幹（Brainstem），運動皮層負責制定運動計劃，併為動作發號施令；而腦幹則負責一些更基礎的運動功能，如呼吸，運動和姿勢的維持等，很多時候不需要主動意識的參與；在大腦裡還有兩個輔助部門，基底神經節（Basal Ganglia）和小腦（Cerebellum），基底神經節負責運動指令的準備和糾正一些在命令傳遞過程中的錯誤；小腦在運動的全過程中行使協調各部門職能的責任。皮層和腦幹的命令發出以後，傳遞到了“地方官員”脊髓或運動神經池（Motor Neuron pools）中，注意這裡有的資訊是直達運動神經節，有的則是透過脊髓神經傳達給運動神經池；運動神經池中的各個運動神經元就開始給肌肉下達幹活（運動）的指令。同時脊髓也會透過各種感覺神經元將運動的結果彙總分析，如果分析出簡單問題則自行處理，複雜問題則上報“中央（運動皮層或腦幹）”等待指示。在正常的機體中，這一套行政體系可以有條不紊的進行。ASL的病變就是發生在由上運動神經元（Upper Motor Neuron， UMN）和下運動神經元（Lower Motor Neuron， LMN）所構成的運動命令資訊傳遞鏈上。UMN指的是不與肌肉直接聯絡的皮層，腦幹和脊髓中的神經元（不包括小腦和基底神經節這種輔助性腦區的神經元）；而LMN則指的是與運動神經連線的基層幹部。在ALS中作為底層的肌肉不會發生病變，只不過隨著神經活動的減弱而萎縮。

圖1。 ALS和運動神經系統［1-2］

ALS的相關基因

每個病患的ALS的病程和症狀差異很大，相關致病因素也是五花八門，相繼有報道稱腦外傷、高血壓、吸菸等因素與ASL有關，

但目前公認與ALS關係最密切的還是年齡和遺傳

。年齡自不用說，是很多神經退行性疾病的最高風險。遺傳性因素也不惶多讓，雖然遺傳性的ALS佔比不高，但仍然有20多個基因被列入了ALS的元兇名單。接下來我們就挑幾個重點的來詳述。

首先登場的是最早發現的

超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1, SOD1）

，1993年發現該蛋白的突變與ALS扯上了關係，雖然現在看來它對ALS的影響不是最大的（大概有20%的遺傳性ALS與之相關），但第一的身份讓它萬眾矚目。SOD1的工作本來是將細胞產生的具有活性的過氧化物（該物質的氧原子上還有額外的電子）轉化成過氧化氫和氧氣。而突變了的SOD1不能完成這個任務，造成神經元的氧化損傷，因此出現病症；不過也有說法是突變的SOD1本身也會聚集形成內涵體，這就有點像PD中的α-synuclein了，但是在ALS中最重要的蛋白聚集並不是SOD1，而是“另有其人”。由於發現得早，做SOD1研究的人多，大家又陸陸續續地把其致病機理扯到了影響軸突運輸，影響脊髓毛細管出血，誘發炎症，破壞髓鞘等方面。

接下來，2001年發現了早髮型ALS相關的ALS2，該基因編碼的蛋白負責核內體轉運；2002年發現了參與RNA加工的SETX；2004年發現了與內質網和胞內膜轉運相關的VAPB；2006年ANG和CHMP2B加入了ALS致病基因家族，前者參與RNA加工，後者與核內體轉運和自噬相關。

到了2008年，另一個大魔王浮出水面，這就是和AD中的tau，PD中的α-syn，HD（亨廷頓病）中的htt並稱“四大惡人”的

TDP-43

，編碼這個蛋白的基因叫做TARDBP，中文全名是反式反應DNA結合蛋白4（transactive response DNA-binding protein 4），雖然該基因的突變也就在不到5%的家族性和不到1%的散發性ASL中出現，看似不過“泯然眾基因”而已，不過在高達97%的病患的運動皮層和脊髓中都發現了TDP-43的內涵體（出現TDP-43內涵體可以不需要這個基因本身的突變，和AD中的tau何其相似！！），讓其搖身一變，炙手可熱。TDP-43平時主要參與和mRNA相關的工作，比如轉錄調控，mRNA的剪下加工，轉運或者代謝什麼的。但在ALS的研究中，人們發現本應該在細胞核內工作的TDP-43大量湧入了細胞質，從而導致了細胞核內“勞動力”不足，TDP-43負責的mRNA無法加工成成品，同時聚集在細胞質中的TDP-43開始躁動，形成包涵體，危害神經元的存活。

圖2。 TDP-43沉積和ALS的相關基因的陸續發現［4］

2009年，對於ALS的遺傳研究來說又是一個豐收的年份，除了發現另一個核內體轉運融合蛋白FIG4以外，還發現了FUS（Fused in sarcoma）蛋白。FUS是一個RNA結合蛋白，它的突變在家族性ALS和散發性ALS中的貢獻分別是4%和1%。針對這個蛋白最開始的研究是在脂肪肉瘤領域（liposarcoma），可以說它本來的功能和TDP-43有一定程度的類似，它們的突變都能促使各自蛋白髮生聚集，從而殺死神經元。

再往後，SPG11（胞內轉移酶，與軸突生長相關），OPTN（自噬相關），ATXN2（RNA加工），VCP（自噬），SIGMAR1（蛋白酶系統，自噬）和UBQLN2（泛素蛋白酶系統，自噬）等相繼被揪出。其中

UBQLN2

（2011年發現）

這個蛋白是位於X染色體上的，也是目前發現的所有有關ALS基因中唯一一個位於性染色體上的，

雖然其突變只在ALS人群中佔2。1%，但是否可以成為闡明ALS發病的男女差異的突破口呢？

但是，2011年ALS真正的主角不是UBQLN2，而是

C9ORF72

，不得不說，起這個名字的人真是太懶了，C9指的是9號染色體，ORF72指的是第72個開放閱讀框。ALS病人中這個C9ORF72片段中的內含子部分中，有一個GGGGCC序列會發生400-2000次的重複，而在大部分非ALS患者中這個片段的重複在10次以內。這種大量重複在家族性ALS中佔比36。7%，散發性ALS佔比為6。3%。另外值得注意的是，C9ORF72的這種改變在家族性的FTD（額顳頁痴呆，以後講痴呆的時候會詳細介紹）中也是常客（25%）。所以在遺傳性的ALS中會經常出現FTD的身影。如果是在延髓性的ALS中，C9ORF72相關的病患比例會進一步提高（44%）。從對這個基因的命名就可以看出，目前C9ORF72的功能還並不是十分確定，只有少數報道說它參與自噬和內涵體運輸。有意思的是，該基因發生改變的ALS病患大多是在歐美，而在亞洲絕大部分地區是相當罕見的。

接下來的時間裡，雖然也陸陸續續發現了接近10個與ALS相關的基因，但還沒有出現C9ORF72同樣量級的ALS基因。所有的基因詳情和比較見圖3，圖中為最熱點的ALS基因標上了顏色，沒有標顏色的並不代表不重要，只是目前研究相對較少而已。

圖3。 ALS的相關基因資訊列表［4］

ALS小鼠模型

ALS不像PD一樣有較好的化學誘導模型，目前最靠譜的模型只能靠基因編輯，因此很多ALS轉基因小鼠也應運而生。如圖3所示，絕大部分ALS相關基因都是常染色體顯性的，因此要讓轉基因編輯小鼠出現症狀並不是難事。如前文所述，SOD1因為先發優勢，針對其開發的ALS模式小鼠非常之多，截止至2019年年中，已經有接近30種之多；TARDBP（編碼TDP-43）相關也有超過30種；FUS有大概接近10種；其餘的如UBQLN2，VCP和VABP的動物模型則比較少。

另外有人可能要問C9ORF72呢？這個當然是有的，不過由於這個基因的外顯子突變是極少的，致病原因是內含子中的片段重複，所以一般是透過BAC敲入或者是病毒轉染構建（也有敲除的）。因此，雖然其發現較晚，但因為其與ALS相關性目前最高，對它的研究很多。綜合目前的多種實驗結果，科學家們提出了三種關於C9ORF72的假說，其一是過度重複的片段造成該蛋白功能的缺失，其二是這些重複所轉錄的正義和反義RNA產生的毒性，其三就是這六個鹼基編碼的二肽重複蛋白產生的毒性。

就動物模型的構建方式而言，過表達ALS相關基因所造成的神經元死亡和運動障礙更加明顯，可以用來模擬患者中晚期的病情（圖4中綠色箭頭代表），而敲入（Knock in）相關基因對小鼠所造成的影響較小，一般被認為可以模擬早中期的病情。

雖然與ALS相關的突變基本沒有“失活（Loss Function）”型的，但基因敲除小鼠仍然是我們研究這些基因功能和ALS深層機理的重要工具。在這些基因中TDP-43純合敲除小鼠是不可以繁衍的，其雜合子表現出一定的對運動神經元的保護作用。而SOD1基因敲除小鼠卻出現了更為嚴重的外周神經疾病，這與SOD1的抗氧化功能是吻合的。

一些點突變小鼠依然可以表現出很好的ALS病理特徵。如VCPR155H在老齡時有50%的運動神經元死亡，同時也能產生細胞內的TDP-43包涵體；不過行為症狀上這些模型仍然有缺憾，該小鼠運動能力的減弱較輕微。

人源化小鼠模型隨著近幾年基因編輯技術的發展而成為熱點，這種方法在將小鼠原有基因的位置上替換上人類的對應基因。人源化FUSδ14小鼠，會讓小鼠細胞中的FUS定位發生紊亂，從而造成運動神經元的死亡。

如果對ALS相關模型小鼠感興趣，可以參考2019年Giorgio發表的一篇綜述［5］，裡面彙總了上百種ALS小鼠的表型和病理特徵，算是小編目前看到最全的了。

如果您需要ALS相關的小鼠模型，賽業生物一站式服務平臺可以為您提供！

圖4。 ALS小鼠模型的應用［5］

關於ALS的介紹就到這了，後續我們的內容將是關於多發性硬化這種神經免疫疾病的，敬請關注。

往期回顧

1。

賽業神經科學雲課堂第一期：無藥可救的神經退行性疾病

2。

賽業雲課堂：帶你瞭解發病率第二的神經退行性疾病—帕金森綜合症

3。

賽業雲課堂第三期：尋找造成帕金森病的兇手，重現案發過程

4。

賽業神經科學第四期：冰桶挑戰背後的神經退行性疾病——漸凍症

參考文獻及引用圖片來源：

1。 Dale Purves et al。 Neuroscience。 Sinauer Associates。 2018。 9781605353807，1605353809

2。 https：//en。wikipedia。org/

3。 Al-Chalabi A ， Hardiman O ， Kiernan M C ， et al。 Amyotrophic lateral sclerosis： moving towards a new classification system［J］。 Lancet Neurology， 2016， 15（11）：1182-1194。

4。 Al Sultan A， Waller R， Heath P， Kirby J。 The genetics of amyotrophic lateral sclerosis： current insights。 Degener Neurol Neuromuscul Dis。 2016；6：49-64

5。 Giorgio F D ， Maduro C ， Fisher E M C ， et al。 Transgenic and physiological mouse models give insights into different aspects of amyotrophic lateral sclerosis［J］。 Disease Models & Mechanisms， 2019， 12（1）：dmm037424。