酸奶還能幫助骨折更快癒合？

磷壁酸有黏附作用嗎

圖片來源@視覺中國

文丨學術頭條

作為很多人的心頭好，酸奶稱得上是一種美味、健康兼得的飲品。

它不僅保留了牛奶本身的香濃和營養，而且因為經歷了發酵過程而擁有酸甜可口、易消化吸收的特點。不僅如此，酸奶中含有的益生菌已被證實有益人體消化系統健康，甚至可以被用於治療或緩解消化道疾病。

然而，你能想到酸奶還能為改良骨外科手術帶來啟發嗎？

近日，來自湖北大學、天津大學、西安交通大學、北京大學、香港大學和華中科技大學的研究團隊就從酸奶中的一種益生菌“身上”找到了靈感。

研究人員透過在鈦種植體表面培養乾酪乳桿菌得到了菌膜覆蓋的改良種植體，並驗證了改良種植體具有抵抗致病菌感染、促進骨結合的作用，以及應用於骨外科種植體手術的潛力。

相關工作以“Engineered probiotics biofilm enhances osseointegration via immunoregulation and anti-infection”為題，於 11 月 13 日線上發表在科學期刊《科學進展》（Science Advances）上。

一種改良種植體的設想

那麼，問題來了，研究人員是如何將酸奶中的益生菌與骨外科手術聯絡到一起的？

眾所周知，骨外科手術是修復嚴重骨折、骨骼畸形的必要方法。骨外科手術中常用金屬種植體（implant）固定損傷的骨骼，來輔助骨骼癒合或維持正常骨骼形態。種植體在植入人體後需要與骨骼形成骨結合（osseointegration），即種植體和骨骼直接接觸（之間沒有任何其他組織間隔）形成骨組織連線。因此，種植體材料通常為生物相容性好的金屬，比如鈦和鈦合金。

在骨外科種植體手術中，種植體與人體組織連線處的致病菌感染和成骨活性不足是導致手術失敗、康復緩慢的兩個主要因素，這些情況的發生也會增加醫療成本和患者的病痛。

為解決這兩個難題，現有方案通常會用抗生素類藥物或重金屬複合抗菌材料（如銀鋅複合材料）來預防致病菌感染；用骨肽和生長因子等促成骨藥物來促進骨結合形成。

然而，這些方案遠非最優解

：抗生素類藥物有破壞人體有益菌群、導致多重感染、產生耐藥病菌的風險；重金屬具有生物毒性，與種植體生物相容性的要求相悖；而外源新增促成骨因子則需要精細設計和嚴格配比，使用起來也並不簡便。

如果換一種思路，直接從種植體方面進行改良又如何？

針對前文提出的問題，理想的種植體應該相應地滿足兩個條件：

（1）具有較高的生物活性，能夠促進骨骼組織的生成，使種植體和骨骼可以較快地產生骨結合；

（2）具有抵抗耐藥性致病菌感染的能力，能夠防止術中和術後感染。

於是，研究人員把目光轉向了醫學研究中越來越受重視的微生物，更具體地說，是已經被廣泛用於食品工業、對人體有益的一類微生物——益生菌。

益生菌在人體內扮演著維持消化道健康的重要角色，具有消殺致病菌、調節宿主消化和免疫系統的作用。因此，益生菌被廣泛應用於治療多種消化道疾病，比如炎症性腸道疾病、腸易激綜合徵、感染性腹瀉等。

但是，活菌進入血液可能帶來菌血症和敗血症的風險，所以大部分益生菌必須口服攝入，這給臨床應用帶來了侷限性。

作為“健康三益菌”之一，乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei， L。 casei）是酸奶中常見的益生菌，在酸奶發酵工業中被廣泛使用。

它能產生細菌素、乳酸、過氧化氫等抗菌物質，對多種致病菌都展現出了優秀的抗菌效能

。它的細胞壁還含有肽聚糖、脂磷壁酸等物質，能夠調節人體免疫系統。

但是，

出於對敗血症風險的擔憂，此前研究從未探索過將乾酪乳桿菌應用於外科手術的可行性

。

圖 | 酸奶（左）中含有乾酪乳桿菌 （右）（來源：Pixabay、Science Photo Library）

種植體植入人體後，會引起初步炎症反應。在這個過程中，巨噬細胞會聚集在種植體表面。巨噬細胞的活動對於調節炎症反應和組織再生具有重要作用，它們能夠分泌成骨因子，如抑癌蛋白M（oncostatin M， OSM）。

成骨因子能誘導間充質幹細胞（mesenchymal stem cells， MSCs）成骨分化，促進骨組織生成、種植體骨結合。而多糖（如脂多糖）能夠啟用巨噬細胞表面的相關受體（Toll-like receptor， TLR），使巨噬細胞產生成骨因子。

細菌附著在物體表面，進行繁殖、分化和分泌胞外基質，形成有組織的膜狀聚集體，稱為

“菌膜”（biofilm）

。菌膜主要由細菌和其周圍的胞外聚合物（extracellular polymeric substance， EPS）基質組成，而乾酪乳桿菌的細胞壁和 EPS 中都含有脂多糖。

研究人員設想，

可以在種植體表面覆蓋一層乾酪乳桿菌菌膜進行改良，種植體植入人體後，種植體表面菌膜中含有的多糖就可以刺激聚集在種植體周圍的巨噬細胞，產生成骨因子，促進骨融合。

圖 | 主要實驗設想（來源：Science Advances）

在種植體表面覆蓋一層乾酪乳桿菌菌膜，在安全無害的同時，還具有抗耐藥性致病菌和促進骨結合的功能。

這正是改良種植體、解決手術難題的可能方案。

“鍍”上一層安全菌膜

研究人員用鹼熱處理的鈦（AHT-Ti）種植體作為培養基質，在其表面培養乾酪乳桿菌（培養時長為 3 天），使種植體表面覆蓋乾酪乳桿菌菌膜。

鹼熱處理的作用是使鈦種植體表面生物活性增加，有利於生物細胞的黏附和增殖，促進菌膜的形成和種植體骨結合，即“活化”。

他們要解決的一個關鍵問題是，如何解決活細菌進入血液導致敗血症的風險？

他們對覆蓋菌膜的種植體進行了短時間紫外線輻射滅活，在殺死細菌的同時，也保留了菌膜中的活性物質。對滅活後的菌膜進行活性檢驗染色（活菌呈綠色，死菌呈紅色），染色後的菌膜呈現紅色熒光（如下圖 C），說明菌膜中的細菌被成功滅活。

透過這種方式，

研究人員成功得到了覆蓋乾酪乳桿菌菌膜的活化鈦種植體（

L. casei

-AHT-Ti）。

圖 | L。 casei-AHT-Ti表面的益生菌菌膜（來源：Science Advances）

那麼，菌膜是否像設想的一樣具備抗致病菌的效能？

研究人員選用目前臨床手術中常見的廣譜耐藥性致病菌——耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）進行了測試。

實驗用未活化的鈦種植體（Ti）、鹼熱處理活化的鈦種植體（AHT-Ti）作為改良鈦種植體 L。 casei-AHT-Ti 的兩個對照組。在三組種植體上分別接種 MRSA 進行培養，每 2 個小時測量一次菌液的光密度（OD），共培養 12 小時。用得到的資料繪製 OD 曲線（如下圖 E）。

圖 | 抗MRSA效能測試（來源：Science Advances）

其中，OD 數值越大，菌液中細菌濃度越高，說明 MRSA 增殖越活躍，種植體樣本的抗致病菌效能越差。從 OD 曲線圖中可以看出，L。 casei-AHT-Ti 的 OD 值明顯低於兩個對照組，說明 L。 casei-AHT-Ti 對 MRSA 有抑制能力。在後續的塗布平板實驗中，

L. casei

-AHT-Ti 的抗 MRSA 的效率達到了驚人的 99.98%。

“喚醒”巨噬細胞、“推進”成骨分化

為驗證 L。 casei-AHT-Ti 是否有啟用巨噬細胞（Macrophage）的效能，研究人員進行了多項實驗。

研究人員首先對三組種植體樣本表面的巨噬細胞進行 DAPI（呈藍色）和 FITC-phalloidin（呈紅色）染色，以觀察種植體表面分布的巨噬細胞的形態和生存能力（如下圖 A、B）。結果顯示，巨噬細胞的形態和生存能力正常，L。 casei-AHT-Ti 對巨噬細胞沒有毒性。

之後，研究人員用 RT-PCR 分別檢測了三組種植體樣本表面巨噬細胞的成骨因子 OSM、促炎症因子 TNF-α、抑炎症因子 IL-10 的表達量（如下圖 C、D、E）。OSM、TNF-α、IL-10 能誘導間充質幹細胞和成骨細胞的骨性分化。可以發現，L。 casei-AHT-Ti 表面巨噬細胞表達 OSM、TNF-α、IL-10 相比對照組都有明顯增多。由此可以推測，L。 casei-AHT-Ti 可能具有啟用巨噬細胞分泌成骨過程相關細胞因子的作用。

圖 | 啟用巨噬細胞效能測試（來源：Science Advances）

除此之外，研究人員還發現 L。 casei-AHT-Ti 表面巨噬細胞的多個成骨細胞分化相關基因表達上調（如下圖 B、C），其中包括能與菌膜中的多糖結合啟用巨噬細胞的脂多糖受體 CD14，與巨噬細胞生產 OSM 相關的 COX2、PGE2、EPR，以及調控炎症反應的 IL-1b、IL-6、TNF-α、IL-10。

據此，研究人員提出了 L。 casei-AHT-Ti 啟用巨噬細胞、促進骨生成的完整過程（下圖 D）：

乾酪乳桿菌菌膜與巨噬細胞接觸，菌膜中的脂多糖與巨噬細胞膜上的 CD14 結合，啟用 TLR，促使巨噬細胞產生促炎症因子 IL-1b、IL-6、TNF-α 和生產 OSM 相關的 COX2、PGE2、EPR，促進初步炎症反應和成骨因子 OSM 的生成，刺激成骨細胞分化

。

圖 | 促使巨噬細胞產生骨誘導細胞因子（來源：Science Advances）

成骨因子的分泌量增加後，能否成功誘導間充質幹細胞骨性分化？為了驗證這一點，研究人員用三組樣本的巨噬細胞培養溶液分別對間充質幹細胞進行孵育，成功證明了

L. casei

-AHT-Ti

能夠在體外實驗條件下增加間充質幹細胞成骨分化。

具備應用於骨外科手術的潛力

但是，要想證明

L. casei

-AHT-Ti 有應用於手術的潛力，僅有體外實驗作為支援是不夠的。

於是，研究人員用大鼠進行了每組樣本量為 3 的體內實驗，他們給脛骨骨折的大鼠分別植入了 3 種種植體，並添加了一組在術中在種植處新增MRSA的實驗，以檢驗大鼠體內條件下不同種植體的骨結合和抗致病菌效能。

實驗結果表明，

在體內條件下，

L. casei

-AHT-Ti 也展現出比兩組對照種植體更優的效能

。

在新增 MRSA 的術後 12 小時進行的塗布平板實驗中，L。 casei-AHT-Ti 相比於 Ti 的抗 MRSA 效率為 98。1%；根據無菌條件術後 4 周進行的三維顯微 CT 計算骨體積分數（BV/TV），以及根據 VG 固定染色計算骨面積比率（bone area ratio），L。 casei-AHT-Ti 的數值都顯著高於兩個對照組。這些結果證明，

L. casei

-AHT-Ti 在體內實驗條件下具有抵抗致病菌感染和促進骨生成、骨結合的效能。

以上結果表明，L。 casei-AHT-Ti 在體外和大鼠體內都具有抗耐藥性致病菌 MRSA 和啟用巨噬細胞、促進成骨分化和骨結合的作用。

用乾酪乳桿菌菌膜改良鈦種植體的成功嘗試，為骨外科手術提供了一條安全性高、富有潛力的新思路。

你是否看好酸奶益生菌這樣“硬核”的開啟方式呢？

參考資料：

https：//advances。sciencemag。org/content/6/46/eaba5723

https：//www。newscientist。com/article/2259871-bacteria-found-in-yogurt-may-help-bone-fractures-heal-faster/