盤點丨國外單分子測序技術代表企業

導讀

本文系統介紹國外幾家測序公司，其各有特色的

測序原理、測序讀長、精度，以及公司代表的產品等

。

單分子測序技術標的公司

作為當代最熱門的測序技術，單分子測序儀的開發在國內外都如火如荼的進行著，下面我們將對國外的幾家單分子測序的代表企業及其技術路線進行詳細介紹。

（一） Helicos公司

1、公司介紹

作為單分子測序技術的開山之作，由斯蒂芬·奎克（Stephen Quake）教授創辦的

Helicos公司

在2008年推出的

Heliscope單分子測序儀

由於讀長太短、售價太高（測序儀100萬美金，試劑48000美元/人），最終在2012年底因為沒有獲得融資而不得不破產。

2013年美國破產法院批准Helicos的請求將智慧財產權售予Illumina, Life Tech, Fluidigm, Complete Genomics，

Helicos公司便從此從人們的視野中消失。

Helicos公司的繼任者是

瀚海基因

，2012年，在奎克實驗室完成博士後工作的

賀建奎教授

回國創立了深圳市瀚海基因生物科技有限公司，繼續開展單分子基因測序技術的研發工作，而Helicos的創始人斯蒂芬·奎克教授正是瀚海基因的首席科學顧問。2015年瀚海基因對外公佈其單分子基因測序儀GenoCare的原理樣機，2017年8月GenoCare正式投產。

2019年8月，深圳市瀚海基因生物科技有限公司官網宣佈，公司已正式更名為深圳市

真邁生物

科技有限公司GeneMind Biosciences Company Limited，簡稱為“真邁，GeneMind”。後續將對GeneMind進行詳細介紹。

2、Helicos單分子測序技術

Helicos遺傳分析系統

是首個基於熒光測序原理的商業化單分子測序平臺，其利用Helicos單分子測序（true single molecule sequencing，tSMS）技術直接測定DNA，能夠對幾個到幾千個鹼基的核酸進行測序，但單位質量序列的產量取決於3‘端羥基的數量，因此相對較短的模板測序效率較高，對於超過1000nt的核酸，Helicos一般建議將核酸剪下至平均長度為100~200nt［1］。

，時長

03：58

①測序過程［2］

-用於測序的DNA大片段首先被斷裂為成千上萬的DNA短片段，並在其3’末端新增

poly(dA)尾

；

-帶有poly（dA）尾的DNA鏈與一次性玻璃flow cell上的oligo（dt）50進行原位雜交，並透過oligo（dt）50帶有的熒光訊號精確定位；

-每一張標準的flow cell上有25條通道，一旦flow cell裝載了適當的樣品，它將與合成和成像測序所需的所有試劑一起插入Heliscope測序系統；

-flow cell插入後，拍攝第一張模板影象，透過 oligo（dt）50末端的熒游標記精確定位雜交模板所處的位置；

-逐一加入熒游標記的單色末端終止子和聚合酶孵育，清洗未結合的單色末端終止子，拍攝影象確定每個DNA序列中的一個核苷酸；

-切割熒光染料和抑制基團，切割後，分離的熒光染料被洗掉，然後加入新的聚合酶和一個單熒光核苷酸，拍攝另一張影象，重複這個過程，直到片段完成測序，如下圖所示。

圖。 Heliscope測序

②優勢及缺陷分析

√優勢：

-簡化了DNA樣品的製備過程；

-靈敏度高，可以讀取單個分子；

-不需要進行PCR擴增，可避免了PCR擴增產生的偏倚和誤差；

-可用於RNA-seq或RNA直接測序；

-對GC含量的敏感性更低，對具有極端GC含量的DNA或基因組測序效率更高；

-所需的試劑和操作步驟較少，只需簡單的片段化 DNA、加poly A尾再進行雜交、測序。

√不足：

-HeliScope讀長較短（55-70個鹼基）；

-資料輸出低（20 Gb），尚不及第二代測序儀HiSeq 2000和SOLiD 4；

-測序的錯誤率較高，雖然可透過重複測序降低錯誤率，但會造成成本的增加。

（二） Oxford Nanopore

1、公司介紹

Oxford Nanopore

成立於2005年，是基於奈米孔單分子實時電訊號測序技術的一家公司。於2021年底在倫交所上市，發行價為425便士，募資3。5億英鎊（約4。7億美元），以發行價計算，Oxford Nanopore市值34億英鎊（約46億美元）［3］。

2、公司/理念發展

公司的測序理念早於

1989年

由美國加州大學戴維斯分校的David Deamer教授所提出，他猜想：蛋白質通道可能嵌入脂質膜中，而且所得的通道可能容納核苷酸個體（DNA的小型組份），每個核苷酸在透過通道時都可能會產生特定的離子電流阻斷，這一概念後來被Hagan Bayley教授所證實；

1991-1996年

Dan Branton教授開始對奈米孔感測概念進行研究，發現透過在脂質雙層中置入奈米孔可引起核酸移位，並指出“因此通道阻斷可用於測量多核苷酸的長度，理論上可以對DNA或RNA單分子中的鹼基序列進行直接、高速的檢測；

2001年，

牛津大學Hagan Bayley教授的實驗室在《自然·奈米技術》期刊中描述了一種可行性的奈米孔感測器：單鏈DNA （ssDNA）分子與拴系DNA鏈結合，可導致透過奈米孔的離子電流發生變化，基於DNA雙鏈體的生存期，不同於單鹼基替換，DNA奈米孔能夠區分長度達30個核甘酸的單個DNA鏈；

2005年

，Oxford Nanolabs作為Oxford Nanopore的前身由Gordon Sanghera博士、Spike Willcocks博士和Hagan Bayley教授（現任牛津大學化學生物學教授）創立。

早在20世紀90年代Deamer等提出使用奈米孔作為生物感測器［4］，感測器可分為

固態奈米孔和生物奈米孔

兩大類，已有文獻證明這兩種型別的奈米孔都能夠在單分子水平上檢測生物和化學分子。固態奈米孔可以從多種材料如硼、鋁、矽、石墨烯以及混合材料中製備，用於進行DNA測序和蛋白質檢測；生物奈米孔是一種跨膜蛋白質通道，可以透過改變特定位點氨基酸殘基的分子生物學技術進行基因工程改造［5］。

3、Nanopore測序技術

①測序原理

基礎技術：

電訊號的測序技術

核心：

蛋白質奈米孔

結構：

兩個電解室透過一層不透水的合成膜分隔開（該膜具有非常高的電阻），將蛋白質奈米孔嵌入合成膜上，用於訊號監測。

原理：

帶有蛋白質奈米孔的合成膜浸沒在電生理溶液中，當電壓施加到電解液室中時，會產生穿過孔的穩態離子電流；進入奈米孔的單分子會對離子的流動造成阻礙（Nanopore訊號），不同的鹼基造成的阻礙大小是不同的，因此可以檢測出不同的鹼基（如影片所示）。

，時長

01：34

影片來源：Oxford Nanopore官網［6］

示例：

以DNA測序為例，Nanopore測序在文庫構建時，在DNA片段上加了一個帶有

Moter蛋白

（DNA解螺旋酶）和

Tether蛋白

（把DNA鏈吸附在測序晶片的膜上）的接頭；Reader蛋白（構成奈米孔）插在一層電阻率很高的薄膜當中，並浸沒在電生理溶液中；當電壓施加到電解液室中時，會產生穿過孔的穩態離子電流；當DNA單鏈透過奈米孔時，會對離子流動造成阻礙，不同鹼基造成的阻礙不同，透過分析電流訊號可獲得DNA序列（如圖［7］）。

圖。 Nanopore測序原理［8］

②優勢及缺陷分析

√優勢：

-測序讀長很長，能直接測定1Mb以上的讀長（有效地解決二代宏基因組測序技術在病原學診斷領域的缺陷）［9］；

-可對單個DNA進行測序，而無需對樣品進行PCR擴增或化學標記；

-對於RNA測序而言，無需把RNA逆轉錄成cDNA，節約時間，降低成本；

-測序通量很高（目前最新版Nanopore的RNA直接測序晶片執行一次可獲得 100萬條全長RNA序列）；

-便攜性強；

-單晶片的通量恰好適用於1-2個標本，可隨時開機測序。

√不足：

-當一段DNA序列中有較少幾個連續相同的鹼基（如2個A）時，奈米孔測序識別A 鹼基的數量可能會產生誤差（測序結果可能為1個A）；

-誤差率較大（在15%~40%之間），測序錯誤主要由插入和刪除鹼基引起。

4、公司代表產品

Oxford Nanopore推出的奈米孔測序裝置包括以下4種：MinION、GridION、PromethION、Flongle。

①MinION—實時、長讀長

MinION是一款行動式、實時、長讀長、低成本裝置，可用於包括疾病/病原體監測、環境監測、食物鏈監測、自我量化，甚至微重力生物學等領域的生物分析。

②GridION—臺式裝置

GridION是一款配有計算模組的臺式測序儀，具有可執行多達五個MinION測序晶片的能力。

③PromethION—大規模、長讀長、直接DNA和RNA測序

PromethION是一款模組化的、按需測序裝置，測序能力高於MinION的近300倍，可執行高達48個測序晶片

④Flongle—MinION和GridION的介面卡

Flongle可在較小的一次性測序晶片上進行直接、實時的DNA或RNA測序。

5、其他資訊

技術關鍵：

其一是合成最小內徑只允許DNA單鏈透過的蛋白奈米孔，且核心區域可容納透過的鹼基數量越少越好（ONT的CsgG是4-6個健基，Illumina的MsgA是3個健基）；其二是演算法。兩者決定了該方法的測序準確度。

價格：

1000-4000美元

準確度：

ONT（Oxford Nanopore Technologies）官方資料，現在DNA主要採用1D建庫，使用R9。4。1晶片，High-accuracy basecalling（HAC）模式進行DNA測序，原始錯誤率5%；RNA測序錯誤率6。1%。HAC是目前最常用的測序模式，市面上的測序公司主要使用這種方式進行測序。雙鏈建庫測序測序準確度是96%，但是會減少資料產量，成本升高。

（三） Pacific Biosciences公司

1、公司的發展與合作

2003年1月，

Science雜誌發表了名為

“Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at High Concentrations”

的文章，ZMW這一概念被提了出來；

2009年，

時隔6年，Pacific Biosciences的創始人Stephen W。 Turner等科學家在Science雜誌上發表了題為

“Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules”

的文章，將ZMW技術應用到了單分子實時測序中；

2017年7月，

諾禾致源及Pacific Biosciences公司宣佈，雙方已經就共同開發並推廣基於PacBio Sequel測序平臺的新型應用程式達成協議；

2018年11月1日，

Illumina試圖以12億美元收購PacBio，然而，可能由於在2020年1月進行冗長的監管審批程式，該交易被終止［10］；

2021年，

Pacific Bioscience以8億美元收購高精度測序商Omniome，這是一家開發高度差異化的專有短讀長測序平臺，其獨有的Sequencing by Binding （SBB）測序方法大大提高了測序技術的準確度［11］；

2021年10月，

PacBio與貝瑞基因聯合開發的三代測序平臺 Sequel II CNDx透過技術要求檢驗；

2022年，

貝瑞基因與PacBio簽署協議，雙方將聯合開發全球範圍內首款基於第三代測序技術的桌面測序儀，據說這款桌面測序儀小巧便捷，可靈活部署，降低了使用門檻，平臺基於SMRT測序技術，能夠提供高精度，超長讀取，均勻覆蓋以及直接檢測鹼基修飾的技術能力，可精準檢測二代基因測序技術（NGS）檢測範圍外的複雜基因突變型別。此外，整套裝置擺放面積較普通測序儀大大減少，成本低且操作簡便，具有出色的價效比［12］；

PacBio最近擴大了與Invitae的合作，包括評估SBB平臺在腫瘤領域的應用；與Twist Bioscience的合作將開發用於HiFi測序的靶向富集產品；與Broad研究所合作正在開發單細胞RNA isoform測序方法，以增加每次讀取的數量，從大約160萬到3300萬；已經與加拿大Canexia Health公司合作［13］。

2、PacBio單分子測序技術

PacBio單分子測序

是基於零模波導（zero-mode waveguide，ZMW）特性的單分子實時測序（single-molecule real-time sequencing，SMRT）。ZMW是一種奈米光子封閉結構，由放置在透明二氧化矽基底上的鋁包層薄膜中的一個直徑約70nm，深度約100nm圓孔組成，ZMW孔的直徑小於光的波長（如下圖），所以當光透過ZMW孔時，光場呈指數衰減，在被照射的ZMW孔內，產生一個足夠小的發光觀察體積，包含一個單核苷酸的DNA聚合酶的活性很容易檢測出來［14］。

PacBio有兩種測序模式：

高精度長讀

（highly accurate long reads，HiFi reads）和

連續長讀

（continuous long read，CLR），見下表。

表。 PacBio兩種測序模式比較

①PacBio單分子測序過程

SMRT是一種並行的單分子DNA 測序方法，以SMRT晶片為載體邊合成邊測序，其測序過程分為以下幾步（如影片/圖所示）：

，時長

01：29

-製備SMRTbell模板文庫，一種封閉的單鏈環狀DNA，兩端加有接頭；

-載入到SMRT cell中的SMRTbell擴散到ZMW的測序單元中，單個聚合酶錨定在每個ZMW的底部並與DNA模板、測序引物結合；

-4種不同熒游標記的dNTP底物隨機進入ZMW底部，當一種與正要合成的鹼基一致的dNTP被DNA聚合酶結合後，激發光從ZMW底部照射進來，使該dNTP發出熒光， 檢測器檢測核苷酸摻入的熒光訊號；

-聚合反應完成後，dNTP上的磷酸基團和熒光基團被切割下來，切割下來的熒光訊號擴散出檢測體積，不再被檢測。

②PacBio單分子測序的優勢及缺陷分析

√優勢：

-無需進行PCR擴增即可對單個DNA分子進行實時測序；

-長讀長，測序資料中有1/2的資料讀長大於20 kb，最長讀長大於60 kb

-測序準確率高，並且無系統誤差，即使是高GC含量的區域，測序的偏倚也較少；

-可在單鹼基解析度下直接檢測DNA鹼基修飾；

-可對AT或GC富集區域以及大的結構變異，包括插入、缺失、倒位、易位、 重複和串聯重複等難以測序的區域進行測序。

√不足：

-機器巨大，硬體成本昂貴，測序成本高；

-測序文庫構建繁瑣，不能直接測定RNA，需要逆轉錄成cDNA才能進行測序。

3、其他資訊

關鍵創新：

零模波導孔（zero-mode waveguides， ZMWs）和熒游標記在核苷酸焦磷酸鏈上（Phospholinked nucleotides）。

準確度：

從天然DNA或RNA分子中捕獲序列資料可實現具有99。9％以上的單分子精度的高精度長讀。

近況：

公司最近在reads長度和準確性方面取得了突破性進展，資料顯示，PacBio可以獲得高達200 bp的reads長度且精度高於Q40，大多數reads接近Q50，也就是每10萬個鹼基中出現一個錯誤；SBB技術錯配錯誤率非常低，可檢測樣本和參考基因組之間真正的變異水平 【注：Q20指錯誤率1%（正確率99%）；Q30指錯誤率0。1%（正確率99。9%）；Q40指錯誤率0。01%（正確率99。99%）】

營收：

PacBio公佈的2021年初步收入為1。305億美元，同比增長65%［15］。

（四） Genia Technologies（羅氏）［16］

1、公司介紹

2009年成立，2014年以3。5億美元被羅氏收購，其中包括1。25億美元的現金和高達2。25億美元的里程碑付款［17］，公司目前仍未推出商業化的測序儀產品。

2、測序原理

Genia測序儀的測序載片以

“跨膜奈米孔陣列”

和

“專用積體電路”

為基礎進行構建，且每個奈米孔上連結有一個DNA聚合酶，理論上該聚合酶將捕獲一條待測核酸分子（線型或環形均可）進行聚合反應，所以在鹼基訊號“載體”產生的方式上，均以“單分子邊合成邊測序”為核心技術路線（參考其核心專利之一CN 104955958 A）。

在其技術上我們可以看到PacBio和Oxford Nanopore的影子，與PacBio的相似點在於其檢測標記均直接接到了聚磷酸基的末端，區別在於Genia的“檢測標記”不一定是“熒光基團”，而是任何可在奈米孔中被檢測到的化學基團或分子，例如乙二醇、氨基酸、化學發光化合物甚至核苷酸等；與Oxford Nanopore相似點在於兩者均為跨膜的奈米孔進行構建，區別在於Genia將聚合酶連結在奈米孔上。

（五） Stratos genomics［18］

1、公司介紹

Stratos genomics公司成立於2007年，總部位於美國的西雅圖。早在2014年羅氏就曾參於Stratos的B輪融資，

2020年被羅氏收購。

2、SBX測序技術

①原理

Stratos開發了

“邊擴大邊測序”

（“Sequencing By Expansion”，SBX ）技術，該技術的核心是一種叫X-NTPs的新核苷酸，和普通dNTPs相比，X-NTPs在鹼基環和五碳糖連線的磷酸基團之間，加入了一個loop，該loop可以分別標記ATCG四種不同的核苷酸，同時在五碳糖和相鄰的磷酸基團之間有一個可切割的linker，當切斷linker後展開的loop長度是原來DNA長度的50倍（如圖），將透過奈米孔時產生的訊號進行放大，每個鹼基的訊號也更容易檢測，同時相鄰鹼基的訊號更容易區分（如圖）。

圖。 加入loop的核苷酸、切斷linker後展開的loop

圖。 鹼基訊號的檢測［19］

②優勢與不足

√優勢：

SBX利用簡單的生化反應將DNA分子的序列編碼成一種高度可測量的替代聚合物，使每個

DNA鹼基的訊號被放大了50倍

，解決了奈米孔測序中訊號微弱檢測難度大的問題，可以準確區分ATCG四種鹼基；

消除了其他測序技術所需的大量樣品製備程式，整個過程很快，不到一小時，使得快速診斷和治療成為可能。

√不足：

SBX的reads

讀長在222bp

，相比於常規三代的長讀長，Stratos還是很短，和二代平臺在一個水平。

（六） 其他公司及技術

除上述列舉的公司和技術外，我們彙總了國外其他的單分子測序公司及其技術路線。

注：部分公司目前還處於早期階段（如國際專利申請），或屬於機密內容並未過多說明。

參考文獻：

［1］Thompson J F， Steinmann K E。 Single molecule sequencing with a HeliScope genetic analysis system。 Curr Protoc Mol Biol， 2010， 92（1）： 7。10。1-7。10。14

［2］Thompson J F， Steinmann K E。 Single molecule sequencing with a HeliScope genetic analysis system。 Curr Protoc Mol Biol， 2010， 92（1）： 7。10。1-7。10。14

［3］https：//baijiahao。baidu。com/sid=1712315457131273709&wfr=spider&for=pc

［4］Deamer D， Akeson M， Branton D。 Three decades of nanopore sequencing。Nat Biotechnol， 2016， 34（5）： 518-524

［5］MagiA， Semeraro R， MingrinoA， et al。 Nanopore sequencing data analysis： state of the art， applications and challenges。 Brief Bioinform， 2018， 19（6）： 1256-1272

［6］Oxford Nanopore官網

［7］俞曉玲， 姜文倩， 鄭玲，等。 單分子測序技術及應用研究進展。

［8］Nature，國盛證券研究所

［9］Van Dijk E L， Jaszczyszyn Y， Naquin D， et al。 The third revolution in sequencing technology。Trends Genet， 2018， 34（9）： 666-681

［10］http：//news。sohu。com/a/560176885_121359185

［11］儀器資訊網

［12］https：//baijiahao。baidu。com/sid=1721742794781682321&wfr=spider&for=pc

［13］騰訊網

［14］Korlach J， Marks P J， Cicero R L， et al。 Selective aluminum passivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures。 Proc Natl Acad Sci USA， 2008， 105（4）： 1176-1181

［15］https：//new。qq。com/omn/20220116/20220116A02TR400。html

［16］知乎

［17］生物通

［18］https：//www。stratosgenomics。com/

［19］網路整理、羅氏官網