《分子細胞》：可愛龍實驗室研發出高效快速的核酸分子診斷工具“HASTE”

北京時間2022年7月13日晚23時，美國康奈爾大學

可愛龍實驗室

在

《分子細胞》（Molecular Cell）

雜誌發表基於type I-A系統的新機制解析和新應用開發的研究成果。

三國有云“天下大勢，分久必合，合久必分”。自然科學亦如是。

CRISPR-Cas系統是原核生物一種抵禦外來入侵核酸的免疫系統，已被廣泛用於真核細胞的基因組編輯。目前基於CRISPR-Cas的基因編輯技術已廣泛應用於遺傳育種、新藥開發、疾病治療、動物模型構建、轉錄調控以及分子診斷等各領域。被譽為在後基因組時代開創了遺傳疾病精準治療的新時代。

CRISPR-Cas系統可以按照效應物是多亞基或單亞基分為Class I和Class II（一型和二型）。單亞基效應物的Class II家族包括大家常用的Cas9， Cas12， Cas13等，因其簡單、高效、普適性的特性，其應用早已風靡全世界實驗室。如果從分佈比例上看，多亞基型別的Class I家族才是CRISPR-Cas系統的“名門望族”，其佔比超過75%，對比Cas9，Cas12，Cas13總和也不過10%左右，可謂呈“輾軋之勢”。然而Class I家族CRISPR-Cas系統，因為多亞基特性，其樣品的獲取，操作的編輯性，功能、機制的研究等都顯得相對難度更大，因此該家族的研究和應用一直滯後很多。

不過近些年，Class I家族引起低脫靶，低毒性，功能更豐富多彩的特性，正逐漸展現出特有的魅力（1-7）。不過Class I家族龐大，成員眾多，同時每一亞類可能又展現不同的性質，因此對這一龐大家族的瞭解也不透徹。

對於Type I系統，大家普遍認知的工作機制是Cascade首先靶向目標DNA，形成full R-loop之後，再招募Cas3完成對靶標DNA的切割和水解。簡而言之就是：“分—合—分”機制。然而可愛龍實驗室胡純一博士等人發現Type I-A 系統一個顯著不同於type I其他系統的性質：Cas3與Cascade是形成一種內在的複合物，而不依賴於目標DNA靶向與否，簡言之就是“合-合-合”。（如下圖所示）

分分合合與否，固然鮮明。然而CRISPR系統最重要的一項性質就是：該系統如何去避免脫靶效應，從而降低非特異性的切割？其他的Type I系統利用Cas3的招募與否來規避脫靶效應（非特異性的靶向不能招募Cas3）。因此，Cas3一直結合在Cascade上的type I-A系統又是如何去規避這一難點？

胡純一博士聯合瑞士洛桑大學/瑞士聯邦理工學院Henning Stahlberg實驗室倪冬春博士等人，使用冷凍電鏡全面解析了type I-A 系統九種狀態下的全景工作機制。這些捕獲的工作狀態橋段，確切的表面，Cas3透過與Cas8的互作，從而成為Cascade的內在一部分，並且Cas3透過穩定Cas8的N端構象，極大的促進了PAM識別和DNA靶向，該結果表面Cas3的內在性是具有積極和重要作用的。重要的是，他們發現，type I-A Cascade結合DNA形成完全互補配對的full R-loop結構之後，透過層層構象變化，最終傳遞給Cas3產生一個巨大的構象改變，暴露核酸酶活性中心，從而開始切割靶向DNA。而部分結合（非特異性結合）靶標形成的partial R-loop結構不能產生這種刺激，Cas3核酸酶依然保持抑制狀態，從而避免脫靶切割 （如下圖）。

眾雲“合（和）為貴”，那麼這套type I-A系統獨特的吸引力在哪裡？胡純一博士等人發現，type I-A 內在式的Cascade-Cas3複合物在不結合目標DNA時，完全沒有任何核酸酶性質，而當有正確的靶標出現，啟用Cas3活性之後，會產生一個附屬活性，從而可以對FQ-ssDNA探針（熒光-淬滅-單鏈DNA探針）進行切割，產生熒光，因此可以透過熒光的強弱即可判斷是否有目標DNA。團隊以此原理，開發了一套高效快速的核酸分子診斷工具，並命名為“HASTE” （heat-activated streamlined nucleic acid detection platform）。該系統可以在15分鐘之內，對單分子量級的DNA完成檢測，效果顯著，有著與傳統PCR一樣可靠的精度，卻極大縮短了時間和成本（下圖）。

有意思的是，該項工作還發現，這個I-A系統Cas3的解旋酶活性嚴格依賴溫度，溫度越高，活性越強。因此可愛龍團隊利用42度溫度刺激，可以開發一套溫控基因敲除工具，效率超過90%。因此，在未來，可以利用該性質，未來可以在病灶透過區域性的溫度刺激來調控該工具的基因編輯效率，從而最大限度地降低基因編輯工具帶來的脫靶效應。

結語：分分合合的性質無關好壞，最後都能抵抗外來侵略（細菌抵抗噬菌體）完成自己種族的延續就是好的系統，type I CRISPR系統如是，人間亦如是。

相關論文資訊：

https：//doi。org/10。1016/j。molcel。2022。06。007

可愛龍教授近照

可愛龍教授

早年畢業於中國科學技術大學，目前於康奈爾大學任教授，獲Robert J。 Appel Professor榮譽頭銜。主攻RNA相關領域的分子機制，包括核酶（Ribozyme）和CRISPR-Cas。在這兩個領域都取得了十分喜人的成績，最近六年發表

Nature

，

Science

，

Cell

論文十餘篇。

可愛龍實驗室目前還有三個博士後名額，分別為生物資訊學，細胞生物和結構生物學方向各一名。正所謂人如其名，可愛龍教授在Ithaca（譯名“綺色佳”），東山腳下，五指湖畔等著有為青年的加盟！有意者請聯絡ailong。ke@cornell。edu

參考文獻

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