如何高效分離外泌體？

女性到

30

歲，內心最大的矛盾便是臉部日漸增多的皺紋、細紋、眼角紋、魚尾紋、法令紋等。為了自己的容貌不被改變，為了讓自己臉部盡顯青春。市面上各種各樣的抗衰需求也越來越多，如：水光針、玻尿酸甚至是幹細胞美容，大家都勇於“嚐鮮”。而作為美容護膚界的後起之秀——“外泌體”，大家更是不願錯過。畢竟它雖然是近幾年興起的美容新興模式，但外泌體的研究歷史也已經有

40

多年了，而它的美容功效更是皆有口碑，比干細胞美容有過之而無不及，一時間，關於外泌體美容的宣傳鋪天蓋地，可謂是風頭無兩，頗有“大佬”的地位。但也正因為如此，我們更要科學嚴謹的對待外泌體美容，瞭解它的原理，才能更好的應用它。

外泌體是指包含了複雜

RNA

和蛋白質的小膜泡

（30-150nm）

，現今，其特指直徑在

40-100nm

的盤狀囊泡。

1983

年，外泌體首次於綿羊

網織紅細胞

中被發現，

1987

年

Johnstone

將其命名為

“exosome”

。多種細胞在正常及病理狀態下均可分泌外泌體。其主要來源於細胞內溶酶體微粒內陷形成的多囊泡體，經多囊泡體外膜與細胞膜融合後釋放到胞外基質中 。

（外泌體分離方法）

外泌體最大的功能便是人體細胞間的

“通訊員”，它能在細胞間傳遞物質，從而調控受體細胞的功能及生物學行為。通俗的說，外泌體就好像一輛“細胞快遞哥”，裝了自家一堆有用的東西（裡面有

miRNA

，

mRNA

和

lncRNA

等小分子核酸，還有細胞因子等蛋白），然後分泌出細胞外，再接著進入另一個細胞，進行“快遞運輸”。

外泌體是胞內體逆出芽形成多囊泡胞內體，多囊泡胞內體與細胞膜融合，向細胞外釋放形成外泌體。幾乎所有的細胞都可以分泌外泌體其存在於大多數種類的細胞和多種體液當中，同時也存在於大多數種類細胞的培養液中。

今天就來給大家普及一下外泌體研究中的第一步：如何高效分離外泌體？

1。

超速離心法

超速離心法是目前最常用的外泌體純化手段，透過高速離心將大小相同的囊泡從樣本中沉澱並純化出來。外泌體超速離心一般和蔗糖密度梯度離心或蔗糖襯墊組合起來分離低丰度外泌體。需在離心機中以

100，000-200，000 x g

離心沉澱（含有外泌體）

120

分鐘，使樣品中的外泌體在

1。13-1。19g/mL

的蔗糖密度範圍內進行富集。

儘管這種聯合的方法可以獲得高度純化的外泌體，但也存在一些缺點。例如同批次最多隻能同時處理

6

個樣本（轉子限制）且回收率不穩定，前期需要準備大量材料且外泌體得率低。最重要的是重複離心很可能對外泌體的囊泡造成損害從而降低其質量，並且一些可溶性蛋白可與外泌體形成團塊而產生汙染。

2。

超濾離心法

超濾離心法是利用不同截留相對分子質量

（MWCO）

的超濾膜進行選擇性分離，小分子物質會被過濾到膜的另一側，而大於膜孔徑的高相對分子質量物質則截留在超濾膜上。

這種方法比較簡單高效，也不影響外泌體的生物活性，但缺點是外泌體可能會阻塞過濾孔，導致膜的壽命減短，分離效率較低。此外，截留在膜上的外泌體間也會發生黏附，導致產量降低。

Tips

：外泌體是直徑

30~100 nm

囊狀小體，大於一般蛋白質。採用此方法需要考慮到與外泌體大小相似的其他囊泡的干擾。

3。

磁珠免疫法

外泌體表面有其特異性標記物（如

CD9

，

CD81

，

CD63

，

CD82

，

Hsp70

，

Ras

相關蛋白

Rab-5b

，細胞骨架蛋白肌動蛋白和

TSG101

等），用包被抗標記物抗體的磁珠與外泌體囊泡孵育後結合，即可將外泌體吸附並分離出來。因為外泌體的異質性與它們的起源一致，不同外泌體上的標記物丰度也不同，透過特定的抗體組合可以從樣本中捕獲不同型別的外泌體，進行選擇性分離。

磁珠法具有特異性高、操作簡便、不影響外泌體形態完整等優點，但是效率低，外泌體生物活性易受

pH

和鹽濃度影響，不利於下游實驗，難以廣泛普及。

4。PEG-base

沉澱法

聚乙二醇（

PEG

）可與疏水性蛋白和脂質分子結合共沉澱，早期應用於從血清等樣本中收集病毒，現在也被用來沉澱外泌體，其原理可能與競爭性結合遊離水分子有關。在

4

℃利用

PEG

孵育後透過過濾或離心即可沉澱、回收外泌體。

採用此種分離方法也存在不少問題：純度和回收率低，雜蛋白較多（假陽性），顆粒大小不均一，產生難以去除的聚合物，機械力或者吐溫

-20

等化學新增物將會破壞外泌體等，因此發表文章時易受質疑。

5。

其他方法（文獻報道）

①交流電動（

alternating current electrokinetic

，

ACE

）微陣列晶片裝置：簡稱

ACE

晶片，該晶片的單個電極的側檢視和俯檢視如下所示，一個裝置中有超過

1000

個電極，其表面塗覆薄薄一層多孔水凝膠，圖中虛線所示

DEP

高場區即外泌體被富集的位置。在晶片電極處被富集的外泌體可直接用掃描電子顯微鏡（

SEM

）和免疫熒光等方法進行分析與鑑定。

該裝置可以從未稀釋的人血漿樣品中快速分離獲取外泌體，需要的樣品量小，在

15

分鐘內將外泌體集中到微電極周圍的高場區域。洗滌去除大量血漿物質後，使外泌體濃縮在微電極上。分離、洗滌及晶片熒光分析步驟在

30

分鐘內就可以完成。

參考文獻：

Ibsen SD， Wright J， Lewis JM， et al。 Rapid Isolation and Detection of Exosomes and Associated Biomarkers from Plasma［J］。 ACS nano， 2017。

6。

外泌體可促進細胞再生。

外泌體可以有效刺激受體細胞，釋放細胞活力，促進其再生和新生。因而可以幫助淡化祛除斑點，促使肌膚光亮細膩。

7。 外泌體可修復受損細胞

外泌體外泌體可以加速

I

型膠原和

III

型膠原的基因表達，促進成纖維細胞增殖、膠原合成，從而讓幫助修復受損的肌膚屏障。而且它可以提高受損部位的修復能力和癒合能力。

8。 外泌體可抑制炎症產生。

外泌體可以誘導巨噬細胞向

M2

型極化，從而降低了巨噬細胞誘發炎症反應的能力，從而抑制炎症。我們肌膚的很多問題都與肌底炎症有關，而外泌體可以透過抑制炎症來讓肌膚從內而外的健康起來。

幹細胞療法圍繞使用完整細胞來替代丟失的組織。相反，外泌體是與細胞分離的囊泡。外泌體促進恢復青春活力的方式是利用外泌體中攜帶的有效成分來幫助其他細胞。

幹細胞和外泌體的另一個主要區別是前者僅從身體的特定部位獲得，例如：骨髓、血液、脂肪組織。而外泌體，可以從幾乎所有型別的細胞中獲得。胎盤中也含有大量的外泌體。

（外泌體與幹細胞的不同）

透過上述科普，大家對外泌體美容一定有了更全面的認識。

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