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腎透明細胞癌致瘤機制：KDM5C基因缺失致使糖原代謝重編和抑制鐵死亡

文章標題：Deficiency of the X-inactivation escaping gene KDM5C in clear cell renal cell carcinoma promotes tumorigenicity by reprogramming glycogen metabolism and inhibiting ferroptosis

發表期刊：

Theranostics

發表時間：

2021。08。04

影響因子：

11。556

合作客戶：

武漢大學

百趣

生物

提供的服務：

PPP、EMP靶標代謝流代謝組學檢測

研究背景

腎透明細胞癌 （ccRCC） 是最常見的腎癌形式，病症表現為富含脂質和糖原的細胞質沉積物增加。研究表明，ccRCC中諸多基因位點發生突變，其中VHL基因和染色質修飾基因KDM5C。儘管已證明VHL缺失可導致糖原累積，X染色體上KDM5C基因失活逃逸導致男性為主要患者，但其潛在機制仍不清楚。

此外，ccRCC患者存活率較低可能與磷酸戊糖途徑（PPP）的上調有關，因此糖原代謝可以作為治療靶點，但是，ccRCC中糖原累積和相關致癌功能的遺傳因素尚不完全清楚。

本文利用全外顯子組與RNA測序評估KDM5C在ccRCC中的功能，結合靶標代謝組學代謝流研究KDM5C如何影響細胞內代謝通量。同時還對小鼠進行KDM5C基因敲除收集更多的體內證據，揭示了組蛋白修飾基因失活突變重程式設計糖原代謝的機制，並有助於解決人類癌症中男性占主導地位的長期難題。

研究內容

具有最高糖原水平的

ccRCC

細胞系存在著 KDM5C 基因移碼突變

對ccRCC 6個細胞系進行高碘酸-希夫 （PAS） 染色和糖原定量測定發現，相比於其他同樣缺乏 VHL基因的癌細胞系，RCC4表現出最高的糖原水平（圖1 A、B）。此外，外顯子測序結果表明RCC4細胞中KDM5C和VHL出現移碼和錯義突變，WB結果發現RCC4細胞中不存在KDM5C和VHL蛋白（圖1 C、D），由此表明癌細胞中的高糖原水平可能與KDM5C突變有關。

為了驗證KDM5C的恢復是否會降低RCC4細胞中的糖原水平，構建了野生型KDM5C或其酶失活突變體H514A的RCC4細胞系，PAS染色結果和糖原定量測定結果表明KDM5C能有效降低糖原水平（圖1 E、F），KDM5C突變促進ccRCC中糖原的形成。

鑑於KDM5C是X失活逃逸基因，作者分析不同性別的患者的情況，發現在ccRCC中頻繁突變的基因中，KDM5C突變表現出最高的男女比例（圖1 G），KDM5C蛋白水平在ccRCC患者中下降，同時糖原顯著增加（圖1 H），這就解釋了為什麼ccRCC患者大部分為男性。

圖1。 X失活逃逸基因KDM5C在糖原水平最高的ccRCC細胞系中具有移碼突變

KDM5C缺失引起

ccRCC

特異性代謝

組學

表型

為了證實KDM5C缺失導致ccRCC發生和糖原積累，作者進行KDM5C敲除實驗。在對照組中，雌性腎臟中的KDM5C蛋白水平高於雄性（圖2 A）。相比於對照組，在50%的KDM5C敲除小鼠中觀察到腎囊腫（圖2 B），其管腔的上皮細胞顯示出強Ki67染色（圖2 C），KDM5C敲除小鼠的腎小管表現出細胞質糖原累積升高（圖2 D）， 表明KDM5C缺失可能引發ccRCC特異性代謝組學表型並促進腫瘤形成。另外，KDM5C敲除穩定細胞系的PAS染色和糖原定量結果均表明KDM5C耗盡後糖原水平增加（圖2 E-H）。

圖2。 KDM5C敲除引發ccRCC特異性代謝表型

為了明確VHL和KDM5C兩者在糖原累積作用的聯絡，作者另外對Caki-1細胞進行敲除實驗，發現VHL和KDM5C任何一種缺失都會導致糖原累積，二者同時敲除存在累加效應，表明KDM5C可能具有獨立於VHL/HIF的調節糖原的能力。（圖3）

圖3。 構建的caki-1細胞系的糖原水平

KDM5C組蛋白去甲基化酶活性是其在調節參與糖生成、糖原分解和PPP的基因表達的作用所必需的

為了探索KDM5C在糖原代謝中的作用機制，作者對ACHN-shKDM5C、 RCC4-KDM5C細胞系以及對照組進行轉錄測序。結果發現KDM5C基因與中樞代謝、HIF反應、氨基糖代謝和轉錄失調相關，表明KDM5C對細胞代謝調節至關重要（圖4 A、B）。除此之外，鑑定了幾個參與糖原合成/降解和PPP的基因，包括HK2、GYS1、PGM1、PPP1R3C以及控制葡萄糖向PPP流動的關鍵基因G6PD，這些基因均在KDM5C敲除後表現出高表達，由此表明KDM5C可能會抑制ccRCC細胞中的HIF基因表達和葡萄糖向PPP分流（圖4 C-E）。

WB結果表明KDM5C表達會降低基因啟動子的H3K4me3水平（圖4 F），且KDM5C敲除會導致除了PPP1R3C之外的那些基因的啟動子上H3K4me3的水平增加（圖4 G），表明KDM5C能夠直接調節HK2、GYS1、PGM1和G6PD的基因表達。由此得到一個結論：KDM5C缺失導致H3K4me3水平提升進而促進糖原相關基因的表達。

圖4。 KDM5C 抑制糖原代謝需要組蛋白去甲基化酶活性

KDM5C抑制葡萄糖向PPP的流動

儘管上述結果表明KDM5C可以同時調節糖原代謝和PPP，但其具體調控的方向仍不清楚。於是作者利用靶標代謝組學代謝流技術確認KDM5C抑制了葡萄糖向PPP的流動。結果發現在恢復KDM5C的RCC4細胞中，G6P、6-PG、R5P、EMP的F6P和乳酸的同位素訊號顯著減弱（圖5 A），表明KDM5C抑制了葡萄糖向PPP的流動和糖酵解。此外，細胞內代謝物定量結果發現RCC4中的G6P水平高於其他ccRCC細胞系（圖5 B），KDM5C抑制了參與PPP和糖酵解的幾種產物的產生（圖5 C和D）。

百趣生物瞭解到，有趣的是，KDM5C同樣有效降低了G6P和NADPH的水平（圖5 E）， 儘管VHL降低了糖原含量，但未能降低G6P和NADPH的水平。與其他代謝物類似，KDM5C突變降低GSH水平。同樣，KDM5C缺失導致ccRCC細胞系的PPP底物G6P、PPP產物NADPH和GSH增加（圖4 F）。

圖5。 KDM5C透過戊糖磷酸途徑抑制葡萄糖通量

KDM5C主要透過促進鐵死亡來抑制致瘤性

PPP在抗ROS活性和腫瘤侵襲上具有重大意義，其中間產物NADPH是鐵死亡的指標。為了明確KDM5C在ROS抗性和鐵死亡中的潛在作用，作者透過ROS誘導處理來比較各種ccRCC細胞系ROS抗性。與其他ccRCC細胞系相比，RCC4表現出相對較高的ROS抗性（圖6 A）。在用TBHP處理後，與RCC4-H514A細胞相比，RCC4-KDM5C有更多的細胞死亡（圖6 B）。同時，在TBHP誘導下，KDM5C導致ROS水平顯著增加（圖6 C）。此外，KDM5C顯著增強了Erastin介導的細胞死亡（圖6 B），這可以被Ferr-1或DFO有效逆轉，但不能被Z-VAD或Nec-1s逆轉。因此，與RCC4-H514A細胞相比，RCC4-KDM5C細胞中Erastin誘導的脂質過氧化增加更明顯（圖6 D）。

圖6。 KDM5C主要透過抑制鐵死亡來抑制致瘤性

KDM5C敲除賦予癌細胞對ROS和鐵死亡的抵抗力

敲除KDM5C後，與幾種ccRCC細胞系對TBHP和Erastin的抵抗力顯著增強（圖7 A、B）。值得注意的是，在糖原磷酸化酶抑制劑（GPI）會抑制其抗性（圖7 C），這表明KDM5C蛋白介導的糖原重程式設計的缺失對於抗ROS和鐵死亡是必不可少的。

圖7。 KDM5C的缺失使老化的腎細胞和ccRCC細胞對鐵死亡具有抗性

癌症相關的KDM5C突變在抑制糖原積累和促進鐵死亡方面存在缺陷

測序鑑定到大部分突變在JmjN和JmjC結構域中富集（圖8 A），為了評估這些癌症相關的KDM5C突變對糖原積累和鐵死亡的影響，選擇了幾個JmjN和JmjC結構域相關的錯義突變，並構建了穩定表達突變蛋白的相應RCC4細胞系（圖8 A）。有趣的是，所有這些突變體都表現得像H514A，不能有效地降低糖原和G6P水平（圖8 B），並且它們都沒有使細胞對鐵死亡或ROS誘導劑敏感（圖8 C）。

圖8。 臨床相關的KDM5C突變體未能降低糖原水平並抑制鐵死亡

基於前面的結果，百趣生物發現作者提出了ccRCC中失活KDM5C突變的模型。如圖9所示，雌性KDM5C有兩個活性等位基因；因此，在單個基因改變後，雌性不會完全喪失基因。相比之下，在男性中，一個腎細胞突變使KDM5C基因的唯一等位基因失活，從而可能透過增加糖原生成/糖原分解和抑制鐵死亡來促進腫瘤發生。因此，男性更容易患ccRCC。

圖9。 失活KDM5C突變和ccRCC發病模型

結 論

該文章揭示了組蛋白修飾基因KDM5C失活突變重程式設計糖原代謝和隨後的PPP，並誘導了鐵死亡抗性，從而擴充套件了KDM5C功能庫，這些功能對於ccRCC的腫瘤發生至關重要，有助於解釋人類癌症中男性占主導地位的長期難題。此外，該研究結果可能表明在ccRCC中靶向糖原代謝的治療價值。

文/阿趣代謝組學