基因敲除，以cre為主

全身性基因敲除［KO（Knockout）］

完全基因敲除，是指在小鼠所有組織細胞中，將靶基因的某些重要外顯子或功能結構域、甚至所有外顯子敲除掉，導致靶基因的表達缺失。

應用：

研究目的基因對全身生理或病理的功能

優勢：

小鼠模型構建週期短；交配流程簡單

劣勢：

大約有1/3的基因純合敲除後會導致小鼠胚胎期死亡或出生期死亡；引發其它基因的代償，導致基因敲除後沒有明顯表型改變

條件性基因敲除［CKO（ConditionalKnockout）］

將某個基因的修飾限制於小鼠某些特定型別的細胞或發育的某一特定階段，實現對小鼠基因組的時空特異性修飾。

應用：

胚胎致死性基因的研究；研究靶基因在特定組織或細胞中的功能；研究靶基因在特定時期或階段發揮的作用

優勢：

多功能的基因敲除模型，可與不同工具鼠靈活搭配使用，客觀而系統地研究目的基因在不同組織器官發生、發育或疾病發生、治療過程中的作用與機制

克服了重要基因完全敲除後的胚胎致死或過早死亡

劣勢：

交配流程較為複雜；小鼠模型構建週期相對較長

基本原理

：

重組酶系統（如：Cre-loxP）介導的位點特異性重組技術。

Cre-loxP系統

是目前最常用的重組酶系統之一，它是來自於大腸桿菌噬菌體P1的重組酶系統。Cre是重組酶（343個氨基酸組成的38kDa），可識別34bp長的DNA序列loxP序列上的Floxed基因。loxP兩側各13bp構成迴文結構，中間8bp為非迴文結構，因此loxP具有方向性。

（N代表可變）

當DNA分子上存在兩個同向loxP序列時，Cre可將兩個loxP序列之間的DNA片段切出並環化，同時將loxP兩側的序列進行連線。

當DNA分子上存在兩個方向相反的loxP序列時，Cre可導致loxP之間的序列發生反轉。

flox小鼠&Cre工具鼠

floxedgene

：

帶有可以被Cre重組酶識別的loxP序列。

flox

小鼠

：

帶有floxed靶基因的小鼠，通常採用DNA同源重組方法，在擬敲除基因片段的兩側分別放置一個同向的loxP位點（loxP位點的存在應不影響該基因的功能（相當於內含子））。

C

re酶：

Causerecombination/環化重組酶（Cyclizationrecombinase）

Cre工具鼠

：

將Cre重組酶的編碼序列置於特定的基因啟動子下，Cre的表達特性決定了靶基因何時何地發生敲除。

Cre表達特異性

Cre在哪一種組織細胞中表達，靶基因的敲除就發生在哪種組織細胞；

Cre的表達水平將影響靶基因在此種組織細胞中進行修飾的效率；

誘導型Cre重組酶透過給予誘導劑，決定在特定發育時期或疾病發生階段，定時地進行基因敲除。

影響Cre表達模式的的因素包括：

Cre上游的特異性啟動子

（廣泛型/組織特異性）；

Cre工具鼠的構建方式

（隨機整合/定點敲入）；

Cre的型別

（組成型/誘導型）

實驗時，將flox小鼠和Cre工具鼠進行交配，最後獲得flox純合且Cre雜合的小鼠。在這類小鼠中，凡是表達Cre的細胞，兩個loxP之間的序列被切除，從而實現組織特異性基因敲除。

誘導型Cre種類

啟動子啟用型

透過誘導劑來調節驅動Cre重組酶的啟動子活性。例如：四環素誘導型、干擾素誘導型

四環素誘導型

tetO

-Cre

將四環素調控系統與Cre-loxP系統相結合，一般需要兩種轉基因小鼠交配使用：

1。由四環素響應啟動子元件（TRE，也叫tetO）控制的Cre工具鼠（TRE-Cre/tetO-Cre）；

2。由組織特異性啟動子驅動的表達四環素轉錄活化因子rtTA或tTA的小鼠。

tetO本身缺乏啟動子活性，無法獨立驅動下游基因的表達。只有當具有轉錄啟用功能的rtTA或者tTA與tetO結合後才能啟用Cre的表達。rtTA或tTA與tetO的結合受四環素或四環素衍生物強力黴素（Dox）的調節。

tTA：沒有Dox時與tetO結合誘導Cre表達；Dox存在時不與tetO結合，Cre不表達。

rtTA：Dox存在時與tetO結合誘導Cre表達；沒有Dox時與不tetO結合，Cre不表達。因此，在tetO-Cre與組織特異性rtTA（或tTA）雙轉基因陽性小鼠中，可以透過給予或撤離Dox來控制Cre重組酶在特定組織中產生的時間。

tetO-Cre與rtTA小鼠聯用，在給予Dox的情況下敲除目的基因

所以，利用四環素誘導條件性基因敲除需要3種基因工程小鼠同時使用，相互交配才能最終獲得flox純合且Cre與rtTA（或tTA）雙陽性的子代小鼠。整個系統較為複雜，繁育及基因型鑑定工作量都比較大。

干擾素誘導型

Mx1-Cre

干擾素誘導是透過Mx1基因啟動子對於干擾素的響應來實現的。Mx1-Cre小鼠在一般狀態下不表達Cre重組酶，但可以透過干擾素-α、干擾素-β或人工合成的雙鏈RNA類似物polyI：C的處理而誘導表達Cre。

利用Mx1-Cre雖然可用於在發育過程中的任意時間點誘導目的基因敲除小鼠，但僅限於在響應干擾素的細胞中。目的基因敲除的效率也依賴於組織或細胞對干擾素的響應水平或干擾素響應細胞的數量。

配體誘導型

透過將Cre重組酶與激素受體的配體結合域（ligand-bindingdomain，LBD）相融合，形成定位於胞漿的融合蛋白，只有在激素誘導後，融合的Cre蛋白才會透過構象變化從錨定蛋白HSP90上解離下來，進入細胞核，識別loxP位點併發生重組。例如：雌激素誘導型

雌激素誘導型

Cre-ER

將雌激素受體（estrogenreceptor，簡稱ER）的配體結合區與Cre重組酶相融合，形成定位於胞漿中的融合蛋白（Cre-ER）。這樣就透過控制雌激素的注射時間，可以實現對基因重組時間特異性的調控。無刺激時，CreER融合蛋白與熱休克蛋白90（HSP90）相互作用並存在於細胞質中

進階版Cre-ERT

為了避免內源雌激素的干擾，在人ER的配體結合區做一個點突變（G521R）就可以使Cre-ER只響應外源的人工合成雌激素（比如：Tamoxifen、4-OHT）的誘導。

豪華加強版Cre-ERT2

另一種LBD突變體融合蛋白被證明對4-OHT具有遠高於Cre-ERT的敏感性，它帶有人ERLBD中的3個點突變：C400V/M543A/L544A。

Cre-ER系統，特別是Cre-ERT2，是目前應用最廣泛的誘導型Cre系統。其較之四環素誘導型Cre，系統更為簡單。我們只需要將Cre-ERT2設計在組織特異性啟動子之後，並與flox小鼠交配，就可透過在特定時間點給予Tamoxifen來最終實現對靶基因的時空特異性敲除。

Flox區的選擇原則

1、插入loxP的位置不能影響基因的正常功能。所以，loxP一般插入在exon兩端的intron中或基因外區域，並且需距exon和轉錄起始位點需有一定距離，以免影響mRNA的剪下或啟動子活性；

2、儘量選擇靠前的長度是非3的整數倍的exon。如果無法選擇靠前的非3的倍的exon，也可選擇關鍵功能區域敲除；

3、儘量避免選擇ATG所在的exon，因為存在著蛋白翻譯以靠後隨機的ATG起始得到功能正常蛋白的風險。如果選擇刪除ATG儘量多連帶後續的exon一起刪除；

4、Flox區不應包含其他基因的功能區域，包括啟動子，CDS，UTR等區域；

5、Flox不宜過大，一方面模型製作難度增大，另一方面刪除區域包含其他基因和未知功能區域的機率大大增加。