郭帆、王平團隊揭示人卵細胞表觀遺傳動態概觀

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近日，中科院動物所郭帆研究員與四川大學王平教授團隊在Cell Press旗下期刊Cell Stem Cell上線上發表了題為“Decoding Dynamic Epigenetic Landscapes in Human Oocytes Using Single-cell Multi-omics Sequencing”的研究論文，該研究透過利用單細胞多組學測序技術，首次揭示了人卵細胞DNA甲基化的建立過程和分子調控特徵。

Cell Press細胞出版社微信公眾號對該論文進行了解讀，旨在與廣大科研人員深入分享該研究成果以及一些未來的展望。

相比於精子和體細胞，哺乳動物成熟卵細胞的DNA甲基化譜是非常獨特的。在小鼠和人類早期胚胎髮育過程中，生殖細胞的前體細胞——原始生殖細胞會經歷大規模的DNA甲基化擦除。在雌性小鼠中，原始生殖細胞隨後經歷特化形成卵原細胞，但仍會維持低水平的DNA甲基化，直到出生後在卵泡發生過程中才重新建立起卵細胞特異的DNA甲基化譜。以往的研究以小鼠為模型，報道了卵細胞發生過程中DNA甲基化建立的概觀及機理。然而，對於人卵細胞重新建立DNA甲基化的過程及其調控因素仍知之甚少。主要原因在於，人卵細胞數目極其稀少，傳統的基於大量細胞的DNA甲基化分析方法無法適用於數量稀有的人卵細胞樣品；另外，在人卵中進行類似於小鼠卵的功能實驗——例如基因敲除或生化分析，幾乎也是難以實現的。所以，要研究人卵細胞DNA甲基化的建立並鑑定影響這一過程的關鍵因素就需要開發出新的工具和分析方法。

研究人員透過建立起的單細胞多組學測序方法——scChaRM-seq（single-cell Chromatin accessibility， RNA barcoding， and DNA Methylation sequencing），首先對多個階段的人卵細胞和卵巢體細胞進行了轉錄組、DNA甲基化組和染色質可及性的分析。研究人員發現人卵細胞在生長過程中伴隨著廣泛的起始性DNA甲基化的發生，並且基因轉錄和染色質可及性與DNA甲基化的重新建立緊密相關。此外，研究人員還發現一些轉錄因子，例如CTCF和SP1，可能透過參與調節染色質可及性來影響人卵細胞中特定位點的DNA甲基化建立。透過在單細胞與多組學層面上對人和小鼠不同時期的卵細胞進行系統性的比較，研究人員進一步發現了人卵特異的DNA甲基化修飾基因位點以及其可能的發生機理。

雖然基因組內的大量重複元件在成熟的人卵中具有較高的DNA甲基化水平，但研究人員發現依然有少量的ALU元件會逃離DNA甲基化並且在卵細胞生長階段高度開放；有趣的是，這一類ALU元件往往存在於重要功能基因的附近，並且其關聯基因在人與小鼠間並不保守。最後，研究人員探索了組蛋白修飾及其修飾酶在人卵DNA甲基化建立中的作用；雖然人與小鼠卵細胞相比，相關組蛋白修飾酶在RNA和蛋白表達上存在一定的差異，但組蛋白H3K4甲基化修飾在拮抗DNA甲基化建立中仍具有重要作用；此外，組蛋白H3K36甲基化修飾很可能也參與人卵DNA甲基化的建立。該研究深入分析了人卵細胞DNA甲基化的從頭建立過程和分子調控特徵，對於理解人類生殖細胞的表觀遺傳程式設計及其相關機理具有重要意義。

作者專訪

Cell Press細胞出版社特別邀請論文通訊作者郭帆研究員

代表研究團隊進行了專訪，請他為大家進一步詳細解讀。

CellPress：

人類卵母細胞中的DNA從頭甲基化有什麼重要作用？這對胚胎髮育有什麼影響？

郭帆研究員：

哺乳動物的發育起始於單細胞的受精卵，母源和父源的染色體DNA各佔受精卵基因組DNA的一半。雖然母源和父源的基因組DNA在序列上非常相似，但在功能上這兩套基因組DNA卻不能相互替換，關鍵原因是母源和父源的基因組攜帶有各自特異的DNA甲基化修飾。其中，來源於卵子和精子的印跡控制區域（germline Imprinting Control Regions，gICRs）在胚胎髮育過程中起重要調控作用。已有的研究表明，絕大部分的gICRs甲基化位點來源於成熟的卵細胞，其DNA甲基化修飾會在受精後被保留下來，只在胚胎期的原始生殖細胞中再被擦除。過去利用基因敲除小鼠模型，人們發現當卵細胞缺失DNA甲基轉移酶Dnmt3a或輔因子Dnmt3l、組蛋白H3K4me2去甲基化酶Kdm1b時，均會影響母源gICRs位點DNA甲基化的正常建立；雖然這些DNA甲基化異常的卵細胞可以正常成熟和受精，但會發生胚胎期致死。人類中的一些胚胎源性疾病，也被報道與母源印跡位點DNA甲基化的異常相關。因此，人卵細胞DNA甲基化的正確建立對於胚胎髮育是非常重要的。

CellPress：

要研究人類卵母細胞DNA甲基化的建立會遇到哪些困難？本研究如何應對這些挑戰？

郭帆研究員：

一是之前所有關於哺乳動物卵母細胞DNA甲基化的研究均來自小鼠模型，而人類生殖細胞的發育時程與小鼠存在顯著差異，所以並不能百分百確定DNA甲基化的從頭建立發生在人卵母細胞生長過程中。這就需要有較強的探索精神，還要提前評估課題失敗的風險並做好心理準備。

二是即使獲得了不同時期的卵母細胞，用什麼方法來精準檢測和分析DNA甲基化的概觀？以往用於測定大量混合細胞DNA甲基化的技術顯然是難以行通的。這就需要在開展正式實驗前建立用於少量細胞或單細胞DNA甲基化檢測的新方法，同時要保證新方法的穩定性、精準性和高效性。

三是如果僅僅只是檢測DNA甲基化，依然難以獲得人卵細胞DNA甲基化從頭建立的機制線索。而人卵細胞自身屬性導致傳統常規的功能研究方案難以奏效，因此需要建立一套全新的分析方案來進行機制探索。

CellPress：

為什麼最終選擇了單細胞多組學測序方法進行研究？

郭帆研究員：

單細胞多組學測序技術是近年發展起來的一系列相關方法的統稱，並被選為Nature Methods期刊2019年的年度方法學。單細胞多組學測序技術既能克服細胞數目少的限制，同時也能多層次、多角度地描繪細胞間的差異，可以系統地反映單個細胞中各層組學之間的直接和潛在聯絡。我在2014年開始對單細胞多組學感興趣並嘗試建立新方法，較早進入這個領域，在2017年率先發表了可以同時測定DNA甲基化和染色質可及性的單細胞多組學測序方法——scCOOL-seq。在我成立課題組後，2018年底我們實驗室發表了改進版本的scCOOL-seq2，對小鼠卵母細胞進行了單細胞多組學解析。與此同時，我們也建立了具有中等細胞通量、可以同時檢測單細胞轉錄組、DNA甲基化組和染色質可及性的scChaRM-seq，用於研究人卵細胞DNA甲基化的建立。因為本身具有一定的技術積累，並且很早就為研究相關問題做準備，所以我們選用單細胞多組學測序並開發出了適用於該課題的方法。

CellPress：

本研究獲得了高精度的人卵細胞多組學資料，實現了很高的基因組覆蓋率，這對後續研究有何幫助？

郭帆研究員：

一是幫助後續研究進一步開展人卵細胞DNA甲基化建立機制的探索；二是為相關疾病的研究提供可以比對的人卵細胞多分子維度圖譜；三是為今後體外培養人工配子提供體內發育的人卵細胞基因表達和表觀遺傳藍圖。

CellPress：

生長期卵母細胞和成熟卵母細胞在DNA甲基化相關基因的表達方面有何差異？

郭帆研究員：

目前已知的哺乳動物DNA甲基轉移酶主要有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B，DNA甲基雙加氧酶有TET1、TET2和TET3。其中，DNMT1和DNMT3A在生長期卵母細胞和成熟卵母細胞均表達；人卵細胞中主要高表達TET3。

CellPress：

本研究發現，在卵母細胞DNA甲基化建立過程中，染色質可及性與DNA甲基化水平密切相關，這說明了什麼？

郭帆研究員：

一是說明人卵DNA甲基化在建立過程中，需要有開放的染色質環境，利於DNA甲基轉移酶與修飾區域的結合。二是說明影響染色質可及性的其它表觀遺傳修飾——例如組蛋白修飾，也會在該過程中起重要作用。三是說明調節染色質可及性的反式作用因子——例如轉錄因子，也會影響人卵DNA甲基化的建立。

作者簡介

郭帆

研究員

郭帆，中國科學院動物研究所、中國科學院幹細胞與再生醫學創新研究院研究員。主要研究哺乳動物早期胚胎髮育與生殖細胞發生過程中的表觀遺傳調控，發展和建立了用於高精度檢測基因組中DNA甲基化修飾、染色質狀態與基因表達的單細胞多組學測序方法，揭示了影響哺乳動物DNA甲基化程式設計與重程式設計的多個關鍵因素，以通訊作者在Nature、Cell Stem Cell、Cell Research、Nature Communications等期刊發表研究論文，獲得國家自然科學基金委優秀青年科學基金資助。

王平

教授

王平，四川大學華西第二醫院教授、主任醫師，婦科主任。從事臨床工作三十餘年，專攻各種婦科疑難重症，擅長多種卵巢疾病、婦科惡性腫瘤及盆底疾病的診治。中華醫學會婦產科分會盆底學組委員、中國醫師協會婦產科專委會生殖道畸形學組委員、中國老年醫學會婦科專委會常委、四川省國際醫學交流促進會婦科專委會主任委員、四川省婦產科質控中心副主任、四川省醫學會婦產科專委會副主任委員、四川省醫師協會婦科專委會常委、四川省預防醫學會婦科腫瘤專委會副主任委員、四川省預防醫學會婦科盆底疾病專委會副主任委員；《實用婦產科雜誌》常務編委、《中華臨床婦幼雜誌》編委。獲中華醫學科技獎兩項、四川科技進步獎兩項。

相關論文資訊

研究成果發表在Cell Press旗下Cell Stem Cell期刊上，點選“閱讀全文”或掃描下方二維碼檢視論文。

▌論文標題：

Decoding dynamic epigenetic landscapes in human oocytes using single-cell multi-omics sequencing

▌論文網址：

https：//www。cell。com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909（21）00169-7#%20

▌DOI：

https：//doi。org/10。1016/j。stem。2021。04。012