農桿菌介導的轉化操縱ABA訊號基因培育穩定的耐旱轉基因玉米植物

引言

題目：Development of stable transgenic maize plants tolerant for drought by manipulating ABA signaling through Agrobacterium-mediated transformation

期刊名：Journal of Genetic Engineering and Biotechnology

單位：Nuziveedu Seeds Limited（印度第一大種子公司）

DOI： https：//doi。org/10。1186/s43141-021-00195-2

小編寄語：雖然文章影響因子不高，但是其中的玉米轉化方法可以借鑑。

賽思基因（www。scientsgene。com），專注遺傳轉化技術的應用於開發，致力於打破基因型限制，助力基因編輯育種。

01

背景

非生物脅迫，特別是在開花期，會對植物的產量產生巨大影響。森林砍伐和城市化使地下水位非常低，並改變了氣候，導致了不合時宜的降雨，並透過乾旱和澇災（非生物脅迫）等壓力影響了作物的產量。透過育種培育耐脅迫植物是一項耗時的計劃，並且在下表現不佳。透過轉基因技術開發抗逆植物是較好的解決方案。玉米是主要的糧食和飼料作物，並且在乙醇生產中具有商業價值。兩個在脫落酸途徑和 ABA 訊號傳導的上游組分中起關鍵作用基因，nced （9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase） 和rpk （receptor-like protein kinase），透過農桿菌介導的轉化，獲得很大的轉化效率。

02

材料與方法

1。 植物材料：商業玉米品系NM74C 和 NM5884；

2。 農桿菌菌株和載體：EHA105農桿菌和載體pMDC99，分別由Lea （Lea P） 和SalT （SalT） 啟動子驅動rpk和nced。這兩個基因都被胭脂鹼合酶（nos）終止子終止。潮黴素磷酸轉移酶基因（hpt II）用作植物選擇標記（圖1）

圖1. 用於農桿菌介導的玉米 ( Zea mays L.)轉化實驗的載體的 T-DNA 組成。

3。 外植體：

植物授粉 （DAP） 後 12 至 15 天收穫的未成熟穗用 10% 次氯酸鈉溶液 （4% w/v） 消毒 15 分鐘，然後用無菌蒸餾水洗滌 3 次，每次 5 分鐘。 解剖幼粒以分離胚胎；其中 2 毫米大小的 IE 僅用作外植體（圖2）。

圖2. 玉米培養的不同階段，從接種的新生外植體（未成熟胚）（A ）到完全發育的硬化植物，經過不同階段的農桿菌介導的轉化，即共培養（B )、選擇 I ( D )、選擇 II ( F )、植株再生 ( H ) 和植株生根 ( I )；沒有共培養的培養物在每個階段都充當對照（C，E和G）

4。 外植體感染與共培養

從農桿菌培養板中挑取的單個菌落接種於 Luria Bertani 肉湯 （LB） 液體培養物中，該液體培養物中添加了利福平和氯黴素各 25 mg/L 的濃度和 50 mg/L 的卡那黴素，並在 28 °C 下透過在200 rpm 過夜，直到達到 0。8 光密度 （OD）。然後將其（懸浮液）以 6000 rpm 離心 20 分鐘，將沉澱溶解在等體積的感染培養基中，然後用於感染外植體（IE）或愈傷組織。

5。 愈傷組織誘導和再生

補充有濃度 1。5 mg/L的 2， 4-二氯苯氧乙酸的 LS培養基用於參與轉化的所有步驟

即感染、共培養，選擇

（再生除外），在我們之前的研究中發現是最好的濃度［1］。補充有 6-苄基氨基嘌呤 （BAP） 和激素的 LS 培養基分別以 0。5 mg/L 的濃度作為再生培養基。

6。 轉基因的表徵

PCR、Southern blot、生理生化指標（離子滲漏、脂質過氧化、脯氨酸和葉綠素、類胡蘿蔔素測定）

7。 乾旱篩選的轉基因玉米盆栽試驗

用三個獨立的轉基因植物與野生型在嚴重缺水條件下（9天）進行盆栽試驗，然後採集葉片樣品用於 ABA 分析。9天后，透過向所有植物平均澆水用來使植物恢復正常。

8。 激素 （ABA） 提取和分析

高效液相色譜 （HPLC） 系統進行激素定量分析。

03

主要結果

1。 遺傳轉化方法：

對於遺傳轉化，首先對外植體進行農桿菌感染（圖2A ），發現這不僅對愈傷組織的生長和愈傷組織的存活率而且對植物的再生都沒有效果。大多數胚胎沒有產生任何愈傷組織並變成棕色；只有少數胚胎誘導初級愈傷組織，但在兩種基因型中均未從中產生小植株；因此，在接種後的不同時間間隔，即10、20、30 和 40 天后，具有起始愈傷組織的 IE 被用於共培養。從外植體中增殖的愈傷組織被傳代培養到補充有激素和頭孢噻肟（500 mg/L）而沒有抗生素（潮黴素）的培養基上。2周後，將愈傷組織轉移至選擇培養基I，然後轉移至選擇培養基II（新增1。5mg/L 2、4-D分別具有10和12mg/L潮黴素的LS培養基），間隔2周。在選擇培養基 II 上存活的轉化愈傷組織已轉移到再生培養基上。在選擇階段和再生階段都研究了愈傷組織的存活頻率（表1）。在整個實驗過程中，未與農桿菌共培養的 IE作為對照（圖2 ）C、E、G）。在這些基因型中，選擇培養基 II 上的存活頻率範圍為 1% 至 46%，再生頻率範圍為 1% 至 25%。在 20 天后進行感染的 NM5884 自交系中發現最大存活和再生頻率為 46 和 25，在 NM74C 自交系中觀察到最低存活 （1%） 和再生 （1%） 頻率。在外植體接種後 20 天進行共培養，導致愈傷組織在繼代培養以及兩個選擇階段的最大存活率（表1）（圖2 B、D、F）。還發現再生頻率在兩個近交系中都最大。愈傷組織生長（繼代培養，選擇 I 和 II）的存活頻率以及再生頻率隨著共同培養時間間隔的增加而增加，最多 20 天，然後隨著時間的進一步增加而降低行。在所使用的兩個自交系中，在所有時間間隔內，NM5884 的愈傷組織存活率和再生頻率均高於其他自交系 NM74C。發現這兩個自交系之間的差異對於存活頻率和再生頻率是顯著的 （ANOVA） （ p = 0。05）。但是，這兩個引數在任何近交系（組變異內）中均未發現顯著（p < 0。05）。

2。 生理生化表徵：

在體外進行的所有實驗中，顯示轉基因生物化學活性水平高於的對照植物。由於大多數症狀與膜損傷有關，因此已在轉基因植物和對照植物的受壓和未受壓葉盤生長的培養基中進行了作為電導率 （EC） 函式的實驗。在有應力和無應力控制之間觀察到離子洩漏隨電導率的顯著增加；另一方面，沒有觀察到任何轉基因之間的顯著差異（圖4）。

圖4. 透過研究正常條件下（未受脅迫）和用甲基紫精模擬脅迫後的電導率，透過離子洩漏研究在農桿菌介導的轉化後再生的假定轉基因玉米植物 (Trg1-3)及其相應的未轉化對照植物的生理特徵。

透過測量受脅迫和未受脅迫的對照和轉基因植物中的 MDA（丙二醛）水平，還透過脂質過氧化對膜損傷進行了生化研究（圖5）。發現對照中的MDA含量在脅迫條件下增加，而在轉基因植株中，觀察到MDA反應物質在脅迫下減少（圖5）。脯氨酸積累研究表明，儘管對照和轉基因植物在脅迫下比在正常（非脅迫）條件下相應的反植物積累更多的脯氨酸，但轉基因植物中脯氨酸的積累明顯多於對照植物。在轉基因中，Trg-2（ET-5）積累了更多的脯氨酸（圖5）。光合色素葉綠素A、葉綠素B、總葉綠素和類胡蘿蔔素的分析表明，除類胡蘿蔔素外，在轉基因脅迫條件下，葉綠素A、葉綠素B和總葉綠素均減少或保持不變。與正常（非脅迫）條件相比，在對照植物中，脅迫條件下色素含量的減少更多。另一方面，在所有轉基因中發現類胡蘿蔔素含量沒有變化或略有增加；而在非轉基因中，發現色素含量沒有變化或略有下降（圖5）。

圖5. 透過脂質過氧化、脯氨酸、葉綠素-A、葉綠素-B、總葉綠素，研究在農桿菌介導的轉化及其相應的未轉化對照植物後再生的假定轉基因玉米植物 (Trg1-3) 的生理和生化特徵。

3。 乾旱篩選的轉基因玉米盆栽試驗

在嚴重缺水條件下對三種獨立的轉基因植物與野生型對照進行盆栽試驗。9天后，透過向所有植物平均澆水來恢復植物。收集葉樣品並進行 ABA 酶測定。使用 HPLC 方法測量 ABA 含量。結果如圖7所示，與非脅迫條件下相比，發現所有轉基因植物在脅迫條件下的 ABA 含量增加，而對照植物在脅迫條件下顯示出 ABA 含量降低（圖7）。在盆栽實驗（體內）中暴露於乾旱的轉基因植物顯示出比對照植物顯著優越的存活能力。將它們放置 14 天，其中處於脅迫（無水）下的對照植物完全乾燥，轉基因植物保持綠色（圖8）。

圖7. 農桿菌介導的轉化後再生的假定轉基因玉米植物 (Trg1-3)及其相應的未轉化對照植物透過 ABA 酶測定在正常條件下（未脅迫）和脅迫後的生化表徵

圖8. 野生型和轉基因品系 (Trg-2) 在有水 ( A ) 和 14 天無水條件下 ( B )的情況

04

討論

在農桿菌介導的轉化過程中，每一步都對所使用的基因型和外植體至關重要且具有特異性；因此，透過改變每個引數，在預選擇和選擇階段以及再生階段研究了生長和再生效率。對於某些基因型，在感染前外植體的預培養是必要的，其中外植體在沒有預培養的情況下沒有反應。在本研究中，外植體培養較長時間（20 天）在誘導愈傷組織後具有積極的反應。

大多數參與乾旱脅迫耐受性的基因將受到 ABA 途徑的影響，因此，ABA 途徑中的基因或改變該途徑的其他基因將影響乾旱耐受性。在

脫水脅迫

盆栽實驗中，非轉基因對照植物在長時間受到脅迫後表現出萎蔫和完全乾燥，而轉基因品系沒有任何萎蔫。透過考慮體外和體內研究一起，nced和rpk這兩個基因的過度表達導致了良好的應激穩定性並積極增加了耐受性。

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參考文獻

［1］ Sridevi M， Pavan Kumar G， Sreenu P， Kodandarami Reddy M， Sateesh Kumar P， Premalatha D （2020） Distinctive response of maize （Zea mays L。） genotypes in vitro with the acceleration of phytohormones。 J Plant Biotechnol 47（1）：26–39。 https：//doi。org/10。5010/JPB。2020。47。1。026

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獲取原文

https：//www。scientsgene。com/h-nd-43。html#_np=107_423

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賽思基因（www。scientsgene。com），專注遺傳轉化技術的應用於開發，致力於打破基因型限制，助力基因編輯育種。