基因編輯HCT116細胞應用—結直腸癌治療研究的絕佳拍檔-源井生物

1.細胞背景與應用現狀

1.1 細胞背景：

HCT116細胞是由M·Brattain等人於1979年從一位患結直腸癌的48歲男性病人中分離得到的。該細胞在半固體瓊脂糖培養基中形成克隆，在無胸腺裸鼠中有致瘤性，形成上皮樣的腫瘤，屬於上皮樣貼壁生長的腫瘤細胞系。

1.2 應用範圍和前景：

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤中發病率位居第三，死亡率位居第二，根據 GLOBOCAN 資料顯示，2018 年全球結直腸癌新增 185 萬例，約 88 萬人死亡，給人類健康帶來了巨大威脅。［1］因此，研究結直腸癌的發病機制以及治療手段對臨床診斷和治療結直腸癌具有十分重要的意義。目前，在藥物開發的最初級階段即細胞生物學水平的鑑定中，HCT166細胞已成為結直腸癌研究領域中被廣泛使用的模式細胞，具體應用舉例如下：

（1） 探究藥物影響結直腸癌細胞增殖，遷移和侵襲的機制。例如：PPARα在白黴素處理的HCT116細胞遷移活性及CYP2S1和CYP1B1的表達中起重要作用［2］

（2） 探究藥物影響結直腸癌細胞生長的體外作用機制，如細胞凋亡和細胞週期改變等。例如：Raddeanin A透過PI3K/AKT通路調控人HCT116細胞凋亡和週期阻滯［3］

（3） 探究藥物對結直腸癌治療的敏感性和耐藥性。例如：Doxorubicin抑制HCT116細胞中miR-140的表達而上調PD-L1，從而使腫瘤細胞對藥物產生耐藥性［4］

（4） 開發新的癌相關訊號通路，為臨床治療結直腸癌提供指導：例如，研究Notch和Wnt訊號通路在結直腸癌細胞HCT116耐藥中的意義等［5］

（5） 開發LncRNA和miRNA在結直腸癌治療中的新途徑。例如：在HCT116細胞中，YWHAE長鏈非編碼RNA透過啟用K-Ras/Erk1/2和PI3K/Akt訊號通路與miR-323a-3p和miR-532-5p競爭，為結直腸癌的治療提供新的靶位點［6］

2.CRISPR/Cas9技術在HCT116細胞中的應用

如上所述，HCT116細胞在結腸癌的各種機制都具有重要的研究價值，而最基本的研究思路一般都從分子層面即基因或蛋白開始，因此CRISPR/Cas9技術的身影也就理所當然地出現在許多研究課題中，畢竟它在研究致癌相關的單基因功能中有著無可替代的優勢。

如發現TRPM4在人結直腸癌中高表達，似乎與結直腸癌細胞的增殖、細胞週期和侵襲有關，透過在HCT116細胞中利用CRISPR/Cas9技術敲除TRPM4後發現腫瘤細胞的遷移和侵襲的確都降低了，同時伴隨著細胞週期的改變［7］； 以及Cell報道利用CRISPR/Cas9技術，將野生型KRAS替換為突變型使得雜合突變的HCT116細胞對藥物治療更為敏感［8］； 再如利用CRISPR/Cas9技術敲除HCT116細胞中的Tks4基因，表現出顯著的上皮間質轉化，細胞運動增加，細胞間的粘附程度降低，發現Tks4基因在EMT調控和腫瘤發展中發揮重要作用［9］； 發現CTC1L1142H突變導致端粒酶維持受損，研究人員利用CRISPR/Cas9技術突變HCT116細胞中的CTC1，證實了CTC1：STN1相互作用為抑制端粒酶活性所必需［10］。

可以看出，研究人員對於CRISPR/Cas9技術的青睞是毋庸置疑的，源井生物提供的CRISPR/Cas9技術服務也為眾多科研人員解決了實驗難題，如細胞敲除不徹底、細胞敲入不穩定等等，讓更多科研人員能順利實現他們的科研目標。

3. 案例分析

3.1 基因點突變[11]

Hiroyuki Kato等研究者利用CRISPR/Cas9技術在HCT116細胞中突變了UTX基因第137和138位氨基酸：G137V和 G137VΔ138，發現原本表達於細胞核的野生型UTX，在兩種突變株的細胞核中表達量大大降低了，而在細胞質中的表達增加了，如圖A-C所示：A，B為免疫熒光圖片，C為Western Blot結果；免疫共沉澱的結果如圖D所示，這是一種新的UTX調控機制，文章中還進一步揭示了UTX與MLL3/4複合物（ASH2L， PTIP and PA1是MLL3/4複合物的成分）相互作用在癌症形成中的重要性。

3.2 基因敲除[12]

Sara Steinmann等人利用CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得了DAPK1缺失型的HCT116單克隆細胞系，最終揭示了DAPK1對結直腸癌侵襲性的影響。

經過Western Blot驗證，Sara Steinmann等人得到了三種DAPK1基因敲除型單克隆細胞（如圖A所示）。免疫熒光實驗檢測pERK1/2主要位於野生型HCT116細胞質，然而在三種敲除型細胞中，pERK1/2均在細胞核中顯著表達。（如圖B所示）

由於絨毛膜尿囊膜模型（CAM）實驗是血管生成的經典體內模型，研究人員將DAPK1敲除型克隆和野生型HCT116細胞移植到雞CAM上，並在蛋中培養5天，發現DAPK1的缺失導致CAM體內生長模式的改變和腫瘤出芽的增強（如圖C所示）

此外，該研究團隊利用大鼠腦3D體外模型發現腫瘤細胞在雞胚胎器官中有更多的擴散，並且侵襲能力也增強了。DAPK缺失型HCT116細胞表現出更多的彌散性腫瘤細胞，並優先在雞胚的肝、心、腦中積累（如圖D所示）。最後，研究人員發現DAPK1-ERK1訊號通路參與了CRC的轉移過程（如圖E所示）。

3.3 基因敲入[13]

Bax是促凋亡Bcl-2基因家族成員之一，線上粒體依賴的凋亡起始中發揮重要作用，R Peng等研究人員在BAX-KO HCT116細胞中敲入了5種位於Bax基因上且與Bcl-2其它成員有相互作用的突變位點。

已有文獻報道BAX-KO HCT116細胞在一種甾醇類藥物 sulindac的刺激下並不會發生凋亡，而R Peng等研究人員發現在BAX-KO HCT116細胞中敲入WT BAX能恢復sulindac和TRAIL引起的HCT116細胞凋亡；敲入K21E和D33A突變，Bax介導的凋亡被完全恢； 敲入D68R和 S184V突變只恢復了一部分，而敲入L70A/D71A突變恢復藥物引起的凋亡程度更低。

該研究是在敲除目的細胞中的目的基因的基礎上，再敲入含有突變位點的目的基因以及WT目的基因（作為對照），便可清晰地瞭解目的基因表達的蛋白和與之相互作用的其它蛋白間相互作用的特定位點關係，是一個驗證透過生物資訊學分析得到的預測位點是否在蛋白質相互作用中真實起作用的好方法。因此，源井生物也為科研人員提供了相應的服務便利，在享受細胞敲入服務的同時，還會得到我們贈送的敲除細胞，滿足科研人員的各種研究需求。

源井生物的獨家專利技術CRISPR-UTM以及5000多例成功案例經驗，讓我們的基因編輯服務更有保障。