雙向電泳樣品緩衝液(sample buffer)選用的基本原則

雙向電泳樣品緩衝液（sample buffer）選用的基本原則

1、蛋白質樣品的特徵：

複雜，含鹽或其他汙染物

易被蛋白酶降解

動態範圍寬（>X106）

溶解性不均一（疏水性/親水性）

分子量、等電點的範圍寬（10-500KDa，pH2-14）

2、樣品分離的基本要求：

高靈敏度和解析度

寬動態範圍

小樣品體積

高通量

合適的溫度和pH

避免蛋白酶降解

適合與高靈敏度的質譜聯用

儘量少的操作步驟減少汙染和損失

3、樣品緩衝液的組成：

3。1 尿素：一種中性變性劑，破壞氨基酸殘基之間的非共價鍵和離子鍵而不影響等電聚焦，濃度範圍5-9。8mol/L，溶液不穩定，降解生成的氰酸根離子與蛋白質的氨基結合改變蛋白質的等電點。加精胺能降低影響。

3。2 硫尿：與尿素一起，能增加疏水膜蛋白的溶解性，缺點是在平衡液裡與蛋白的半胱氨酸競爭結合碘代乙醯胺，會使蛋白的烷基化不完全，硫尿還有抑制SDS與蛋白質結合的作用，也可能增加脂類的溶解性，影響二向的效果。一般是2mol/L的硫尿與5-7mol/L尿素結合使用。

3。3 去汙劑：蛋白質在去摺疊後，會暴露出大量的疏水性殘基，去汙劑用於破壞蛋白質分子間的疏水相互作用。陰離子去汙劑SDS，不利於穩定等電聚焦中蛋白質的等電點，濃度不超過0。25%，

NP-40：SDS>=8：1，常用的有非離子型去汙劑Triton X-100和NP-40，兩性離子去汙劑CHAPS，SB3-10等。非離子型去汙劑和兩性離子去汙劑能在不破壞蛋白質結構，保持生物活性的情況下改善蛋白質的溶解度，但是必須選擇合適的濃度，濃度太低不能改善蛋白質的溶解性，濃度太高會使蛋白帶變寬，影響解析度和引起紋理現象。各種去汙劑結合使用濃度範圍0。5-4%。

3。4 還原劑：還原劑能開啟蛋白質的二硫鍵。一般使用β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇（DTT）和二硫赤蘚糖醇（DTE），DTT和DTE本身帶有電荷，在等電聚焦時會遷移到pH範圍以外，從而使某些蛋白質的二硫鍵重新配對使溶解度降低而重新沉澱下來。一般的濃度範圍10-100mmol/L，非離子型還原劑如三丁基膦（TBP）2mmol/L能增加蛋白質的溶解性，並可幫助蛋白質從第一向轉移到第二向。不過TBP有劇毒，操作時應相當小心，並做好防護工作。

3。5 載體兩性電解質：它有兩個基本特性，一是兩性的，能夠在分離柱中達到一個平衡位置，二是可以作為“載體”，能夠“運載”電流和pH能力。Biolyte是在丙烯乙胺與乙烯亞胺縮合並蒸餾得到的多胺混合物中再引入磺酸基團或磷酸基團後合成的。其他特性是分子量小，可溶性好，緩衝能力強，導電性均勻，紫外吸收低，不發熒光，無毒、無生物學效應，具有螯合性質。所有載體兩性電解質分子都荷電，只是在溶液中荷正電和荷負電是相等的，所以總的淨電荷為零，當引入電場時，載體兩性電解質分子將向陰極和陽極移動，當它達到淨電荷是零的位置時才停止從而給出一個pH梯度。也必須選用合適的濃度，一般使用的濃度範圍是 0。2-2%。

3。6 蛋白酶抑制劑：蛋白酶抑制劑能夠暫時或者永久性的破壞蛋白酶的活性，減少蛋白質被降解和修飾的可能性。

3。7 DNase I 和RNase A。消化DNA和RNA，減少汙染。