高中三種酶的固定化方法

酶的固定化方法歸納起來大致可以分為三類，即載體結合法、交聯法和包埋法。

1、載體結合法是指將酶固定到非水溶性載體上的方法。根據固定方式的不同，這種方法又可以分為物理吸附法、離子結合法、共價結合法和共價鍵結合法。

（1）物理吸附法是指將酶吸附到固體吸附劑表面的方法。從載體對酶的適應性來看，這個方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破壞，酶的高階結構變化也不明顯，但其缺點是酶與載體的相互作用較弱，被吸附的酶極易從載體表面上脫落下來，不能獲得較高活力的固定化酶。該方法常用的載體有活性炭、多孔陶瓷、纖維素及其衍生物、甲殼素及其衍生物等。

（2）離子結合法是指透過離子鍵將酶結合到具有離子交換基團的非水溶性載體上的方法，載體有離子交換樹脂等。該方法的處理條件溫和，且酶的高階結構和活性中心的氨基酸很少發生變化，因而可以得到較高活性的固定化酶。採用此法固定的酶有葡萄糖異構酶、糖化酶、

β

一澱粉酶、纖維素酶等。

（3）共價結合法是指酶和載體以共價鍵的形式結合在一起的方法，這種方法需要酶和載體都具有氨基、羧基或羥基等官能團。在溫和的條件下能偶聯的蛋白質基團包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基。參加和載體共價結合的基團，不能是酶表現活力所必需的基團。

此法曾先後用於3‘ -核糖核酸酶、5’ -磷酸二酯酶和葡萄糖澱粉酶等的固定化。此外酶透過物理吸附或離子吸附於載體制備固定化酶也是常用的方法。

（4）共價鍵結合法是將酶與水不溶性載體以共價鍵結合的一種方法。此法研究較為成熟，其優點是酶與載體問連線牢固，即使用高濃度底物或離子強度的溶液進行反應，也不會導致酶和載體的分離，因此具有良好的穩定性及重複使用性。缺點是反應條件比較苛刻，常常會引起酶蛋白高階結構發生改變，導致酶的活性中心受損。

2、交聯法是指透過雙功能試劑，將酶和酶聯結成網狀結構的方法。常用的交聯劑是戊二醛，但單用戊二醛等試劑交聯製備的固定化酶活力較低，因此常將此法與吸附法、包埋法結合使用，可以達到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。酶蛋白的遊離氨基、酚基、咪唑基及疏基均可參與交聯反應。

3、包埋法是指將酶包裹在多孔的載體中，如將酶包裹在聚丙烯醯胺凝膠等高分子凝膠中，或包裹在硝酸纖維素等半透性高分子膜中。前者包埋成格子型，後者包埋成微膠囊型。

包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進行結合反應，很少改變酶的空間構象，酶活回收率較高，因此可以應用於許多酶的固定化。但是此法只適用於小分子底物和產物的酶催化反應，因為只有小分子反應底物或產物，才可以透過高分子聚合物進行擴散。

包埋法制備固定化酶除包埋水溶性酶外還常包埋細胞，製成固定化細胞，例如可用明膠及戊二醛包埋具有青黴素醯化酶活力的菌體，可連續水解帑基青黴素，工業生，產6-氨基青黴烷酸。

酶固定化的意義：

酶經過固定化後，比較能耐受溫度及pH的變化，最適pH往往稍有移位，對底物專一性沒有任何改變，實際使用效率提高几十倍（如5‘ -磷酸二酯酶的工業應用）甚至幾百倍（如青黴素醯化酶的工業應用）。

酶固定化後一般穩定性增加，易從反應系統中分離，且易於控制，能反覆多次使用。便於運輸和貯存，有利於自動化生產。固定化酶是近十餘年發展起來的酶應用技術，在工業生產、化學分析和醫藥等方面有誘人的應用前景。

與自然酶相比，固定化酶和固定化細胞具有明顯的優點：

1、可以做成各種形狀如顆粒狀、管狀、膜狀，裝在反應槽中便於取出，便於連續、反覆使用。

2、穩定性提高，不易失去活性，使用壽命延長。

3、便於自動化操作，實現用電腦控制的連續生產。

酵母細胞的固定化實驗：

1、製備固定化酵母細胞

（1）酵母細胞的活化：

1g乾酵母+ 10mL蒸餾水→50mL燒杯→攪拌均勻→放置1h， 使之活化。

（2）配製

CaCl

2

溶液：

0。83g

CaCl

2

+ 150mL蒸餾水→200mL燒杯→溶解備用。

（3）配製海藻酸鈉溶液：。

0。7g海藻酸+ 10mL水→50mL燒杯→酒精燈微火（或間斷）加熱，並不斷攪拌，使之溶化→蒸餾水定容到10mL。

（4）海藻酸鈉溶液與酵母細胞的混合：

將溶化的海藻酸鈉溶液冷卻至室溫，加入活化酵母細胞液，攪拌後吸入到注射器中。

（5）固定化酵母細胞：

以恆定速度緩慢地將注射器中的溶液滴加到

CaCl

2

溶液中，形成凝膠珠狀顆粒。

2、固定化酵母細胞的發酵

（6）沖洗：將固定的酵母細胞凝膠珠用蒸餾水沖洗2~3次。

（7）發酵： 150mL10%葡萄糖+固定化酵母細胞→ 200mL錘形瓶→密封→25℃發酵24h。