Nature Commun｜劉志勇組與李洪傑組合作克隆小麥抗白粉病基因Pm24

小麥在我國已經有幾千年的種植歷史，種植區域幾乎遍及全國各地。我國幅員遼闊，生態環境、氣候環境、土壤型別和種植方式的不同，加之漫長的自然進化和人工選擇，逐漸形成了豐富的小麥地方品種資源。在現代小麥遺傳改良過程中，因為對產量的追求和少數骨幹親本品種資源的利用，導致小麥品種遺傳基礎日益狹窄，有些品種抗病蟲害能力逐漸下降甚至喪失。小麥白粉病（Blumeria graminis f。sp。 tritici）是危害小麥生產的主要病害之一，我國的小麥地方品種蘊含豐富的抗白粉病基因資源，一些地方品種具有良好的白粉病抗性。迄今，從我國小麥地方品種中發掘出的抗白粉病基因或等位基因包括Pm4e（D29）、Pm5d（PI 83395）、Pm5e（復壯30）、Pm24（齒牙糙）、Pm24b（白葫蘆）、Pm45（D57）、Pm47（紅洋辣子）和Pm61（鬚鬚三月黃），另外還有多個臨時命名的抗白粉病基因或等位基因，但是這些小麥地方品種來源的抗白粉病基因尚未被克隆。

為了解我國小麥地方品種對白粉病菌優勢菌株的抗性，自2006年秋季我們開始對收集到的地方品種進行苗期抗病性鑑定，發現許多地方品種對白粉病菌株E09表現中抗或高抗，甚至免疫，其中來源於陝西的地方品種葫蘆頭表現高抗。之後王振忠同學在中國農業大學攻讀博士學位期間（2010年9月–2015年6月）構建了石4185×葫蘆頭的遺傳分離群體，利用E09菌株接種F1、F2代和F2：3家系進行遺傳分析，發現葫蘆頭的白粉病抗性由顯性單基因控制，暫時命名為MlHLT。透過BSA分析發現MlHLT與1DS染色體臂上的SSR標記Xgwm337連鎖；進一步篩選找到了4個與MlHLT連鎖的SSR標記Xgwm106、Xbarc119、Xcfd83和Xcfd72，將MlHLT定位於9。3 cM的遺傳區間。為進一步加密MlHLT遺傳區間，利用1DS染色體臂的EST序列開發多型性分子標記，獲得與MlHLT緊密連鎖的EST-STS標記Xwggc33，以此為基礎尋找與該EST序列同源的粗山羊草SNP標記延伸序列、短柄草、水稻和高粱基因組序列中的同源基因，開展比較基因組分析，開發了多個多型性標記，將MlHLT錨定在分子標記Xwggc3026和Xwggc3148之間3。6 cM遺傳區間，對應於粗山羊草基因組約13。4 Mb物理區間（Wang et al。 2015）。

由於來源於葫蘆頭（HLT）的抗白粉病基因MlHLT與地方品種齒牙糙（CYC）和白葫蘆（BHL）中的抗白粉病基因Pm24（Huang et al。 1997）和Pm24b（Xue et al。 2012）均定位在小麥1DS染色體上大致相同的區間，於是我們進行了等位性測驗，發現所有正反交組合［HLT×CYC（4，517 F2）， HLT×BHL（4，318 F2）， CYC×HLT（4，382 F2）， CYC×BHL（4，590 F2）和BHL×HLT（4，692 F2）］的F2單株均高抗E09菌株，表明MlHLT、Pm24和Pm24b可能是等位基因或同一個基因（郭麗，2016）。隨後利用93個全國各地採集的白粉病菌株對葫蘆頭、齒牙糙和白葫蘆進行了抗性評價，發現這3個地方品種對全部菌株都表現抗病性（圖1），且抗病反應型沒有明顯的差異，說明MlHLT、Pm24和Pm24b具有廣譜白粉病抗性。因此克隆MlHLT、Pm24和Pm24b具有重要的理論和育種應用價值。

圖1 葫蘆頭、齒牙糙、白葫蘆和Chancellor對36個白粉病菌系的抗性表現

進一步利用粗山羊草的基因組序列資訊開發多型性分子標記，使用3，720個單株的F2作圖群體進行精細作圖，將抗白粉病基因MlHLT定位在Xwggb241和Xwggb244兩個標記之間0。06 cM遺傳區間，對應粗山羊草品系AL8/78的532 kb物理區間。序列分析和基因註釋發現，MlHLT在中國春和粗山羊草的物理定位區間內均預測出6個候選基因：類受體激酶基因RLK1和RLK2、具有兩個激酶結構域的小麥串聯激酶基因（Wheat Tandem Kinase）WTK3、具有CC-NBS-LRR結構域基因CNL、假定蛋白HP和核糖體蛋白RP。分別從葫蘆頭和石4185中擴增這6個基因的全長DNA序列，發現僅有WTK3和CNL兩個基因在葫蘆頭和石4185間存在序列差異，且在抗、感親本苗期葉片中均表達，其序列差異均導致了所編碼蛋白的氨基酸序列變異。與石4185相比，葫蘆頭中的WTK3基因在第3內含子處存在一個C/G的SNP變異，在第5外顯子上存在一個6 bp的缺失，導致所編碼蛋白有2個氨基酸（K400G401）的缺失；而石4185的CNL基因在第2外顯子上有一處T/C的SNP引起的非同義氨基酸突變，在第3外顯子上有一個單核苷酸缺失，分別引起編碼蛋白的錯義和無義突變（圖2）。由於串聯激酶基因WTK3和CNL基因都可能與抗病性相關，因此將二者均作為候選基因進行後續的功能驗證。

圖2 小麥抗白粉病基因MlHLT圖位克隆（Lu et al。 2020）

我們分別構建了WTK3基因自身啟動子驅動基因組全長序列的互補載體和玉米Ubiquitin啟動子驅動全長CDS的過表達載體，以及CNL基因自身啟動子驅動基因組全長序列的互補載體（圖3a），透過農桿菌介導的方法轉化高感白粉病小麥品種Fielder，利用E09菌株接種T0代轉基因植株和T1代家系，發現WTK3基因的互補載體和過表達載體轉基因陽性植株均對白粉菌E09表現高抗，而CNL基因互補載體的所有轉基因陽性植株都表現高感反應型（圖3b），證明候選區間內的WTK3基因為MlHLT。

圖3 小麥抗白粉病基因MlHLT轉基因功能驗證（Lu et al。 2020）

同時，利用EMS誘變葫蘆頭創制感病突變體，對M2代家系人工接種E09菌株進行篩選，獲得了26個純合感病突變體。對這26個感病突變體的WTK3和CNL基因全長DNA序列（包括啟動子區和3’端序列）進行擴增測序，序列分析表明其中11個突變體在WTK3基因上發生了無義突變、錯義突變（非同義氨基酸變異）和內含子-外顯子拼接位點的改變（圖4），在CNL基因上未發現突變位點。其中突變體Mut410和Mut1091的突變導致WTK3基因提前形成終止密碼子；Mut1106的突變發生在WTK3基因第4內含子和第5外顯子交界處，導致產生新的讀碼框發生移碼突變；其餘8個突變體的突變位點分別發生在WTK3基因的Kinase I和Kinase II兩個激酶結構域上，且大部分突變發生在激酶的保守氨基酸殘基上。突變體分析再次證明了WTK3為抗白粉病基因MlHLT。

圖4 小麥抗白粉病基因MlHLT突變體功能驗證（Lu et al。 2020）

對齒牙糙和白葫蘆中的WTK3基因序列進行了全長擴增，發現兩個品種與葫蘆頭中的WTK3基因序列完全一致，說明MlHLT、Pm24和Pm24b為相同的基因。為了進一步瞭解Pm24基因在不同小麥種質資源中的序列變異，比較了7個粗山羊草和17個普通小麥中的WTK3基因全長基因組序列（10，410 bp），發現WTK3基因序列存在非常多的SNP和InDel變異。根據主要的序列變異特徵可將這些種質的WTK3基因劃分為4個單倍型組（Group 1 – Group 4；圖5），其中的第一個單倍型組（Group 1）包括葫蘆頭、齒牙糙、白葫蘆、石4185和百農AK58等9個普通小麥品種（系），第二和第三單倍型組（Group 2和Group 3）均為粗山羊草，第四個單倍型組（Group 4）包括中國春等8個普通小麥品種（系）。與其它3個單倍型組相比，第一個單倍型組在WTK3基因的第7內含子上有一個1，509 bp的序列插入，然而WTK3基因第5外顯子上的6 bp缺失（5880-AAAGGA-5881）只存在於第一個單倍型組的葫蘆頭、齒牙糙和白葫蘆這3個地方品種中，其餘21個小麥和粗山羊草品系均未發現這6 bp缺失。

圖5 小麥抗白粉病基因WTK3全長序列單倍型組（Lu et al。 2020）

為了進一步明確WTK3基因6 bp缺失與其抗白粉病功能的關係，利用覆蓋第5外顯子該6 bp缺失區域632 bp序列的STS標記InDel-WTK3擴增了1，069份國內外多樣化代表性種質，包括粗山羊草、中國小麥微核心種質、中國小麥地方品種、國外小麥地方品種等。序列比較發現該區域序列可分為10種單倍型（Hap I – Hap X； 圖6），其中單倍型I（Hap I）僅包括葫蘆頭、齒牙糙、白葫蘆和紅芒麥４箇中國小麥地方品種，這4份材料與其餘1，065份材料的差異在於WTK3基因第5外顯子上均存在6 bp缺失。序列分析發現紅芒麥的WTK3基因全長基因組DNA和cDNA序列均與葫蘆頭、齒牙齒和白葫蘆3個地方品種的WTK3基因完全一致，且對36個白粉病菌株都表現高抗反應型，表明紅芒麥也含有Pm24基因。

圖6 小麥抗白粉病基因WTK3第5外顯子區域序列單倍型（Lu et al。 2020）

WTK3基因編碼具有兩個激酶結構域（Kinase I和Kinase II）的串聯激酶蛋白（Tandem kinase protein， TKP），其中抗病等位基因WTK3HLT與感病等位基因WTK3S4185編碼蛋白相比缺失了第400位的賴氨酸和401位的甘氨酸，這兩個氨基酸的缺失發生在其預測結構的兩個α螺旋之間的loop區域，而非在Kinase I結構域的保守氨基酸殘基上。在自然界中，WTK3基因在其第5外顯子上發生6 bp缺失後使WTK3HLT基因獲得了抗白粉病功能（Gain of function），在發生缺失的位置未發現任何其它形式的變異。那麼WTK3基因在其第5外顯子上6 bp缺失部位缺失3 bp或缺失更多鹼基，是否同樣能賦予WTK3基因抗白粉病功能？為此，我們構建了另外3種過表達載體遺傳轉化Fielder，分別是ProUbi：WTK3#1（編碼的蛋白缺失第400位的賴氨酸）、ProUbi：WTK3#2（編碼的蛋白缺失第401位的甘氨酸）和ProUbi：WTK3#3（編碼的蛋白缺失第399位的賴氨酸、第400位的賴氨酸、第401位的甘氨酸和第402位的色氨酸）（圖7a）。結果發現ProUbi：WTK3#1、ProUbi：WTK3#2和ProUbi：WTK3#3所有T1代轉基因陽性植株都高感白粉病，只有缺失第400位賴氨酸和第401位甘氨酸兩個氨基酸的ProUbi：WTK3HLT載體轉基因陽性植株表現高抗，表明只有WTK3基因第5外顯子上缺失這特定的兩個氨基酸才能使其獲得抗白粉病功能，缺失其中的一個或更多個氨基酸都不能賦予其抗白粉病功能。

圖7 小麥抗白粉病基因WTK3第5外顯子6 bp缺失與抗病功能相關（Lu et al。 2020）

串聯激酶蛋白是一類新的參與植物免疫反應的激酶家族。目前在植物中發現的具有明確功能的串聯激酶基因包括大麥抗稈鏽病基因RPG1（Brueggeman et al。 2002）、大麥抗散黑穗病基因Un8（Zang et al。 2015）、小麥抗條鏽病基因Yr15 （WTK1） （Klymiuk et al。 2018）、小麥抗稈鏽病基因Sr60 （WTK2） （Chen et al。 2019）和小麥抗白粉病基因Pm24 （WTK3）。根據其兩個激酶結構域的氨基酸殘基序列保守性，WTK1蛋白是激酶-假激酶（Kinase-pseudokinase）結構、WTK2和Un8是激酶-激酶（Kinase-kinase）結構、RPG1是假激酶-激酶（Pseudokinase-kinase）結構。對WTK3蛋白的激酶結構域進行序列比較發現，WTK3蛋白的第一個激酶結構域（Kinase I）保守氨基酸殘基與典型的激酶，如BIK1、Pto、Stpk-V、RPG1、WTK1和WTK2的激酶結構域保守序列相似，表明WTK3的第一個激酶可能具有激酶活性功能；而第二個激酶結構域（Kinase II）相應的氨基酸殘基保守性較差，推測其與WTK1和RPG1中的假激酶結構域類似，可能為假激酶。有兩個EMS感病突變體在第一個激酶功能域的關鍵保守氨基酸殘基上發生了突變，說明WTK3蛋白的第一個激酶結構域對其白粉病抗性功能至關重要；但是也有部分EMS感病突變體在第二個激酶結構域的關鍵保守氨基酸出殘基上或鄰近氨基酸殘基上發生了突變，表明第二個激酶結構域對WTK3蛋白的白粉病抗性功能也有重要作用。

進化分析發現，WTK1、WTK2和Un8可能來源於激酶結構域的融合，而RPG1和WTK3 可能來源於激酶結構域的重複（圖8）。RPG1中Kinase I和Kinase II的氨基酸序列一致性為53。0%，而WTK3中Kinase I和Kinase II的氨基酸序列一致性僅為29。3%，表明WTK3中兩個激酶結構域發生重複的時間相對較久遠。WTK3在中國春和粗山羊草中都存在等位基因（TraesCS1D02G058900。1和AET1Gv20142700。38），在中國春和硬粒小麥Svevo的1B染色體上存在其部分同源基因（Homeologs或Homoeologs） （TraesCS1B02G075800。1和TRITD1Bv1G020600。1），但是在野生二粒小麥品系Zavitan的1A和1B染色體，中國春、硬粒小麥Svevo和烏拉爾圖小麥G1812的1A染色體上均未發現WTK3的部分同源基因，很可能是在小麥的進化過程中A基因組上的WTK3部分同源基因發生了丟失。此外，在大麥和黑麥1H和1R染色體上存在WTK3的直系同源基因（Orthologs），在短柄草、水稻、玉米和高粱中均存在WTK3的同源基因（Homologs），但均位於非共線性的基因組區域。以上結果表明WTK3基因的產生可能發生在禾本科植物發生分化之前。

圖8 小麥抗白粉病蛋白WTK3與植物蛋白激酶結構域的比較分析（Lu et al。 2020）

小麥抗白粉病基因Pm24編碼的WTK3蛋白是首次發現具有兩個激酶結構域的串聯激酶具有抗白粉病功能。WTK3蛋白的兩個氨基酸缺失賦予了Pm24基因的白粉病抗性，這種稀有的自然變異目前僅發現存在於中國小麥地方品種中。葫蘆頭、白葫蘆、紅芒麥和齒牙糙是收集自陝西和河南的小麥地方品種，從其地理分佈推測是普通小麥引入中國之後在陝西關中平原及其鄰近地區上千年的種植過程中，在病原菌選擇壓力下而產生的自然突變，之後被當地農民選擇留存下來。抗病性鑑定和分子標記檢測未在現代小麥育成品種中檢測到含有Pm24基因，表明該優異基因在現代小麥育種中未能得到應用。該廣譜抗白粉病基因的克隆使其在未來的小麥抗病性遺傳改良，尤其是分子標記輔助選擇和基因組編輯育種中具有較大的應用潛力。除Sr60外，目前已經發現的這些串聯激酶基因均對其致病真菌具有廣譜抗性，而且僅在麥類作物中發現串聯激酶結構域基因具有抗病性功能，這可能預示著串聯激酶所參與的植物抗病途徑，或與病原菌的互作為麥類作物所特有。

小麥抗白粉病基因Pm24（WTK3）的克隆由中國科學院遺傳與發育生物學研究所劉志勇課題組與中國農業科學院作物科學研究所李洪傑課題組合作完成，中國科學院遺傳與發育生物學研究所劉翠敏課題組、中國農業大學、北京農學院、湖北省農業科學院植保土肥研究所俞大昭團隊、美國UC Davis和USDA-ARS等單位的科學家參與了該項研究，研究結果於2020年2月3日線上發表於Nature Communications雜誌（Lu et al。 2020）。

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