細胞培養過程中如何預防支原體汙染？細胞被支原體汙染怎麼解決？

導讀：在細胞培養過程中，支原體感染髮生率超過50%，支原體存在水平較高的研究專案的成果還曾見刊於包括細胞（Cell）、自然（Nature）和美國科學院院報（Proceedings of the National Academy of Sciences）等知名雜誌。雖然支原體汙染的存在並不能說明這些研究發現是無效得，但這種細菌卻可以影響數百個基因的表達水平，並且透過與細胞競爭營養物質而阻礙細胞的生長。因而細胞培養過程中的支原體汙染是一個世界性難題。當細胞（特別是傳代細胞）被支原體汙染後，細胞內的DNA、RNA及蛋白表達發生改變，而細胞的生長率一般並未發生顯著的影響，因而細胞被支原體汙染一般難以察覺。同時支原體可透過一般過濾膜（0。22-0。45μm），對於生物製藥領域而言，小試中我們幾乎不會使用0。1μm的除病毒過濾膜來過濾培養基（生產中通常都會進行除病毒來保證原液質量），那麼小試結果在支原體汙染的情況下就顯得不那麼可靠了，尤其是科研工作者往往不會在第一時間懷疑自己的培養物受到了支原體的汙染。

細胞支原體汙染原因分析 什麼是支原體

培養細胞中支原體汙染的來源包括:所使用的動物來源的一些產品如血清、工作人員或已被支原體汙染的細胞株系。

汙染培養細胞的支原體一般是寄生於人 、 牛或狗的少數幾種型別 。 細胞培養上清中支原體的濃度可達 107 / ml， 而培養的細胞看起來很正常 。 不管是肉眼觀察還是顯微鏡下觀察 ， 受支原體汙染的細胞可無明顯變化 。 但是支原體汙染可使研究結果的真實性和可靠性大大下降 。 由於競爭營養及支原體有毒的代謝產物 ， 支原體汙染可顯著影響生產用細胞的培養及相應生物技術的發揮 ， 影響生物製品的生產 。

支原體汙染帶來的影響

（1）細胞外形可以沒有明顯的變化，支原體可以與細胞共存，汙染後細胞液不會死亡，培養基一般不發生渾濁；

（2）使用被支原體汙染的細胞做實驗會嚴重影響實驗的結果，因為支原體會抑制細胞生長；導致染色體畸變；細胞膜抗原性改變；細胞復甦後存活率降低等。

（3）影響細胞的代謝和功能：培液中的精氨酸被支原體大量消耗，引起細胞蛋白質、DNA、rRNA、mRNA的合成障礙；支原體活動使培液成分發生改變（如發酵型支原體降解糖類產生酸性物質），影響細胞代謝。

（4）培養過程中細胞破碎較多，培養基pH變化明顯，需要頻繁更換新鮮培養基；

（5）細胞被支原體汙染後會形成共生體系導致汙染不斷擴大。

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應對支原體汙染的策略

細胞一旦發生了支原體汙染， 應當棄之。雖然已有了針對支原體的抗生素及最近出現的所謂支原體清除劑， 這些方法只能殺滅細胞外的支原體。有一部分支原體可侵入到細胞內部。我們用掃描電子顯微鏡觀察支原體汙染細胞時， 也在細胞內看到了支原體。細胞內的支原體可逃避支原體清除處理。這些細胞內的支原體顆粒可再度離開細胞， 去汙染更多的細胞。所以對支原體汙染細胞中清除支原體的工作，實際上是非常困難的， 幾乎不可能徹底清除支原體。除非是不可替代或無法重新獲得的細胞， 一般沒有必要進行支原體清除工作。

在科學研究和開發研究中， 避免支原體汙染及減少支原體汙染對科研、開發工作影響的最好方法就是定期對培養的細胞進行支原體檢測。這種常規支原體檢測可最大限度降低支原體汙染， 確保排除未知支原體與細胞相互作用而產生的嚴重後果。尤其是在研究領域， 常忽視培養細胞中支原體的汙染， 或對支原體汙染程度估計不足。迫切需要提高認識， 加強對培養細胞支原體汙染的檢測。

在日常細胞培養工作中可採用以下幾點來控制支原體的汙染問題：

1 。從可靠來源引進、使用細胞， 特別是知名的信譽良好的專門機構， 如ATCC 、基礎醫學細胞中心等， 這些機構對細胞質量進行一系列檢測。

2 。預防為主：細胞培養實驗室應制定嚴格的管理制度，按照規範的實驗程式操作。操作人員在細胞培養與配置培養基時避免不必要的交談、佩戴口罩、手套與帽子；維持實驗室環境衛生

3 。定期對實驗室中的培養物進行支原體檢測。這也是國外一些重要實驗室的經驗。一旦發現已經汙染支原體的培養物， 滅活後棄之。更換新的培養物。避免支原體的進一步播散。

4，控制環境汙染，定時進行空間消毒，生物安全櫃超淨臺定期進行消毒滅菌，在培養箱水源中加入消毒滅菌劑

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