運用棉花酵母文庫發現LEA3基因能夠增強棉花抗乾旱和鹽脅迫

前言

棉花是世界上天然纖維的主要來源。近年來，氣候變化給植物帶來的乾旱、高鹽等滲透脅迫，使棉花產量穩步下降。為適應變化莫測的氣候，植物不斷進化出複雜而有組織的應對非生物脅迫的反應機制，其中數千個抗性相關基因間的相互作用，在提高植物的抗旱性和耐鹽性中發揮著重要作用。功能基因組學研究表明，植物胚胎髮育晚期豐富蛋白（LEA）就是這樣一種基因，它在植物發育過程中，面對多種環境脅迫時均有表達，對提高植物的抗旱性和耐鹽性具有重要作用。

2022年3月，

中國

農業科學院棉花研究所

在

International Journal of Biological Macromolecules

上發表了題為

“Late embryogenesis abundant gene LEA3 (Gh_A08G0694) enhances drought

and salt stress tolerance in cotton”

的研究論文，該研究發現LEA3能夠增強棉花的抗旱性和耐鹽性。

該專案中所用的

棉花酵母文庫

由歐易生物構建。

本研究首先對不同物種間的LEA3蛋白進行了系統發育樹構建，結果顯示LEA3蛋白分為7個不同的分支，且發現了四倍體、二倍體棉花和其他植物中LEA3蛋白的進化關係。此外，本研究對LEA3家族的基因結構、序列重複、啟動子上的順式調控元件功能以及染色體定位等均進行了詳細的分析。其中GO分析結果顯示GO： 0006950（響應刺激和非生物脅迫的生物過程）是GhLEA3的唯一GO term（圖1）。

圖1 | LEA3基因在染色體中的分佈、基因結構和GO分析

本研究以MG-85陸地棉為實驗材料，採用種子水培至三葉期開始進行鹽和乾旱脅迫處理，並於脅迫後的0-12h和24-48h內，每間隔3h進行樣品採集。RT-PCR檢測到，在0-48 h的乾旱和鹽脅迫下，棉花GhLEA3基因在不同組織中的表達量顯著增加，尤其是在根和葉中（圖2）。

圖2 | GhLEA3在乾旱和鹽脅迫條件下的表達分析

亞細胞定位實驗顯示，GhLEA3定位在細胞葉綠體。功能驗證實驗發現，GhLEA3敲除後，棉株對乾旱和高鹽脅迫的敏感性增強。表現為在乾旱和鹽脅條件下，GhLEA3敲除後棉株與野生型棉株相比，在形態、生理和分子指標上均出現顯著變化，如莖/根鮮重降低，葉綠素含量降低，葉片相對含水量降低，離子滲漏增加；POD含量下降，MDA含量上升等；脅迫相應相關基因表達量下降。這說明GhLEA3 （Gh_A08G0694）基因敲除棉株對乾旱和高鹽脅迫的敏感性增強。值得注意的是，GhLEA3基因敲除棉株，在自然條件下與野生型無顯著生長差異（圖3）。

圖3 | GhLEA3 敲除棉株在乾旱、鹽脅迫條件下的生理、生化及相關基因表達分析

同時，在擬南芥中過表達GhLEA3 （Gh_A08G0694），結果顯示Gh_A08G0694基因的過表達增強了植株對乾旱和鹽脅迫的抗性。具體方法為，首先透過RT-qPCR表達分析，從T2代中篩選出GhLEA3表達量最高的T3純合子代進行脅迫實驗，然後透過觀察及檢測，結果發現過表達株系在形態、生理和分子指標上表現均優於野生型對照組（圖4）。

圖4 | GhLEA3 過表達植株在乾旱、鹽脅迫條件下的生理、生化及相關基因表達分析

為進一步瞭解LEA3蛋白在乾旱脅迫下調控植物生長和增強抗旱性的分子機制，本研究以乾旱脅迫條件下的棉花根莖葉為材料，構建了棉花乾旱脅迫酵母文庫。並以GhLEA3為誘餌，採用

酵母雙雜交

篩選實驗，從

棉花酵母文庫

中篩選獲得了GhLEA3互作蛋白，並對互作蛋白進行了GO和KEGG分析，發現其中的互作蛋白GhVDAC1主要參與鈣訊號通路和cGMP-PKG訊號通路，互作蛋白GhGAPA參與多種生物途徑，如糖原生成和代謝途徑。此外，GhVDAC1和GhGAPA受乾旱脅迫誘導表達顯著，且在GhLEA3敲除的棉株中表達量低於野生型棉株（圖5）。

圖5 | GhLEA3互作蛋白及表達量分析

總結

本研究發現Gh_A08G0694基因屬於LEA3家族，透過與VDAC1、GAPA的相互作用，可以幫助植物進行脅迫訊號轉導，提高線粒體的穩定性，增強植物的非生物脅迫耐受性，在提高棉花耐鹽抗旱性方面發揮著關鍵作用，本研究為進一步認識和理解棉花耐鹽抗旱性的遺傳和分子機制提供了重要依據。

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End本文系歐易生物原創