未標記的待測RNA的量依賴於目的序列的丰度和標記探針的比活性

13。將切下的凝膠碎片轉入滅菌的微量離心管中，加入正好足夠覆蓋凝膠的凝膠洗脫緩衝液（200~500uL）。蓋好離心管在搖床。上室溫過夜。

14。用微型離心機最大轉速離心5min。

15。用移液器將上清轉入新的離心管，小心避免吸入聚丙烯醯胺凝膠沉澱。用液閃儀檢測標記探針應為1X 10‘*cpm/uL。

（可選）為最大限度地回收RNA。在步驟15向凝膠沉澱中加200uL凝膠洗脫緩衝液。蓋好離心管在招床上室溫過夜。重複步驟14和步驟15。

16。於-70C 儲存探針。

17。為定量製備的待測RNA中目的序列的量，設定——系列包含恆定量放射性標記探針、恆定量對照RNA （如缺少目的序列的RNA）和一定量（lfg~ 100pg）的體外合成的標準制備的RNA。

總細胞RNA（ 10ug）包含10fg~ lpg稀有mRNA和約300pg中等丰度的mRNA，如β~肌動蛋白和磷酸甘油醛脫氫酶。

18。轉移0。5~150ug的RNA （待測的和標準的）等分到滅菌的離心管中。向每-個管中加入過量的均勻標記的單鏈DNA探針。未標記的待測RNA的量依賴於目的序列的丰度和標記探針的比活性。

用放射性標記的高比活性的DNA（>10“cpm/mg），10ug總RNA通常足以檢測到1~5複製/細胞水平的mRNA。為了檢測更低量（如從雜合的細胞群體中提取）的RNA，可以在30uL的雜交反應中使用大約150ug 的RNA。DNA探針相對於靶RNA應當是過量的。