Nature：陳萬澤等開發活細胞轉錄組測序技術

唯一不變的就是變化本身，對細胞而言亦是如此

。一個受精卵發育為一個複雜個體，正常體細胞變成腫瘤細胞，細胞作為生命的基本單位，其狀態的動態變化既是健康發育的基礎也是疾病產生的原因。從光學顯微鏡對細胞形態變化的觀察，到綠色熒光蛋白對細胞基因、表達定位等變化的追蹤，再到分子記錄器在基因組中穩定寫入曾經發生的分子事件，以及單細胞轉錄組測序的發展允許了細胞全轉錄組的變化擬時序推測，每一次細胞動態變化記錄的技術變革都極大的推動了細胞生物學的發展。同時，應當認識到，既有的方法要麼受限於對細胞形態或者少數幾個基因的動態表徵，要麼依賴於擬時序分析中多種在實際細胞體系中可能無法滿足的

假設，我們目前還不能直接地測量細胞全轉錄組狀態變化。

2022年8月17日，

中國科學院深圳先進技術研究院

與

瑞士洛桑聯邦理工學院

Bart Deplancke課題組、蘇黎世聯邦理工學院Julia Vorholt課題組合作，在

Nature

發表了題為：

Live-seq enables temporal transcriptomic recording of single cells

的研究論文。

深圳先進院合成生物學研究所

陳萬澤

研究員

（原瑞士洛桑聯邦理工學院博士後）

、Orane Guillaume-Gentil、Bart Deplancke和Julia Vorholt為共同第一作者。

這項研究開發了

活細胞轉錄組測序技術

（Live-seq）

，

首次實現了讓單細胞進行轉錄組測序後依然能夠保持細胞存活

。

該技術兼具全基因表達解析度和動態解析能力，是目前對單細胞轉錄組直接動態測量、偶聯細胞現有狀態和其後續表型的唯一解決方案。

基因表達程式的變化是細胞對外源和內源刺激反應的重要表現。對單個細胞的連續觀測一直是細胞對刺激反應、變化的重要研究手段，活細胞成像應該是最早的方法。隨著顯微成像技術的發展和熒游標記手段的進步，顯微成像已經可以實現從從體外細胞培養到體內環境下實現對基因表達的動態觀測。基因編輯技術的發展促進了分子記錄器的出現。透過細胞原生的或者人工合成的基因線路，對刺激的感應並將資訊寫入基因組，實現對歷史分子事件的記錄

。這些技術的發展和應用，促進了細胞生物學的研究，如活細胞成像已經成為了現代細胞生物學實驗室的常用的一種手段；分子記錄器雖然出現不久，但是它在體內多場景的適用性和穩定性上有很大的潛力。但是，它們在記錄基因表達上有一個共同的限制：在一個細胞中只能同時記錄一個或幾個基因的表達。

另一方面，自2009年

湯富酬

等人首創了

單細胞mRNA測序

以來

，我們不再只依靠少數幾個基因的表達來了解細胞型別，而可以用整個轉錄組的狀態來更加系統全面的定義細胞型別和狀態。單細胞轉錄組變革了我們對細胞狀態異質性的解析能力，推動了發育生物學、腫瘤細胞學、免疫學和幹細胞生物學等各個領域的發展。然而，我們只能測量細胞的靜態狀態，無法像前述的活細胞成像那樣連續觀測細胞的動態或者檢查細胞後續的表型。為了克服這個限制，多種基於計算或者標記的方法被開發出來，這些方法基於一個共同的假設：群體的靜態分佈可以模擬個體的動態運動。透過不同的數學模型和/或對新舊RNA的標記等手段，把轉錄組相似的細胞連線起來產生一條軌跡來代表一個細胞的變化路徑。這些方法提供了大量有意義的生物學認知，但是同時值得注意的是，由於這些方面的前提假設在複雜細胞系統不一定能被滿足，其提供的變化路徑應該被解讀為一種統計學上的預期，而非細胞真正變化的軌跡

。而這些限制的根本原因是單細胞測序時裂解殺死了細胞，因而無法連續測量。

針對這個挑戰，陳萬澤研究員和合作者此次開發了活細胞轉錄組測序Live-seq，在進行單細胞轉錄組測序後，依舊保持細胞的存活和功能。其核心是對部分細胞質進行微創地提取，並對及其微量的細胞質RNA進行擴增。具體地，該方法整合改造了多種跨學科技術

（圖一）

：

1）具備奈米級移動解析度和皮牛頓力學靈敏度的原子力顯微鏡，實現超精密顯微操作；

2）亞皮升級別的微/納流控通道和液壓調節系統，實現微量（約1皮升）樣品提取和轉移；

3）奈米級的、中空可定量的、可和細胞膜無縫密封的特殊探針，可以實現微創的細胞質提取；

4）相偶聯的實時跟蹤成像和細胞培養系統，可以長時間鎖定同一個細胞；5）高靈敏度的RNA擴增測序；

6）對前述步驟的無縫整合。

圖一 Live-seq的基本原理

Live-seq只是對少量的細胞質進行測序，其結果是否能代表細胞的狀態？為了回答這個問題，作者對多種型別和狀態的細胞進行活細胞測序，並平行地和單細胞測序結果進行比較。結果顯示活細胞測序結果和單細胞測序結果高度吻合，證明了Live-seq能夠很好的體現細胞的全轉錄組狀態。另一個疑問就是這個過程是否會改變細胞狀態甚至殺死細胞。首先，作者對包括幹細胞在內的多種細胞型別進行評估，發現絕大部分細胞在Live-seq後仍然存活。同時，細胞分裂依然能夠正常進行

（圖二）

。然後，透過對巨噬細胞對細菌脂多糖LPS刺激的反應和脂肪幹細胞分化過程的觀測，發現細胞的反應沒有因Live-seq有明顯變化。最後，對接受和未接受細胞質提取的細胞全轉錄組進行比較，也未發現大量的基因表達變化。這些結果顯示，Live-seq沒有對細胞的活性和功能產生較大影響。

圖二 Live-seq對細胞的影響。黃色的細胞被提取了細胞質，藍色和紫色的細胞沒有被處理

由於細胞測試後仍舊存活，Live-seq首次實現對同一個細胞全基因表達的連續測量。作為概念驗證，Live-seq直接測定了同一個巨噬細胞和脂肪幹細胞在刺激前後的變化路徑

（圖三）

。Live-seq可以回答細胞怎樣的過去決定了它的現在。即使是單克隆來源的巨噬細胞對細菌脂多糖的反應依舊有很大的異質性。利用這個模型，作者展示起始狀態的少數基因的表達差異和噪音

（如Nfkbia，Gsn等）

是決定細胞後續反應差異的重要原因，同時處於細S期的細胞對刺激反應也更弱。對應的，普通的單細胞轉錄組無法找到這些規律。

圖三 活細胞測序的新可能：（左圖）對同一個細胞轉錄組的連續分析；（右圖）偶聯細胞起始的轉錄組狀態（因）和後續細胞對刺激的反應（果）

Live-seq仍然有多個缺點

。比起高通量的單細胞轉錄組，Live-seq還是一個低通量的手段；Live-seq目前還不能在體內應用；在高度極化而mRNA分佈不均的細胞

（如神經細胞）

中，Live-seq可能無法體現全細胞轉錄組；更加多次的取樣對細胞的干擾還需要更多的研究。透過未來持續的發展，如自動化提高通量、透過和雙光子顯微鏡聯用運用於體內樣品等，這些缺點有望得到改善和克服。儘管仍然有很多不足，Live-seq第一次使得對活細胞的連續觀測成為可能，希望這個可能可以催生更多新的可能。

論文連結

：

https：//www。nature。com/articles/s41586-022-05046-9