你絕對不能錯過的RNA提取小技巧｜小嗅找找
2022-06-22由 小嗅找找 發表于 農業
小麥怎麼提rna
Everybody 看過來，今天小編要給大家推送一個深度好文，解決大家在植物RNA提取方面遇到的問題。這可是我們公司有三年RNA提取經驗的妹紙的精華大作，好好學習前輩們的經驗，你絕對會受益無窮~
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植物RNA提取過程
植物組織成分相對於動物組織來說複雜多樣，因此其RNA的分離和純化的難度也隨之加大，如果要完美的資料結果，那麼提取純度高、完整性好的RNA就成了關鍵所在。
植物RNA的提取一般會經歷以下幾個過程：
1。破碎細胞壁
2。裂解細胞膜
3。雜質去除，包括：DNA、蛋白質、多糖、多酚、次生代謝產物等
4。純化和濃縮RNA
而在RNA提取過程中，純化除雜的過程是影響RNA純度的關鍵所在。在完整的細胞內，多糖多酚類化合物，次級代謝產物，蛋白質如RNase等與核酸是分離的，一旦細胞破碎，這些物質就不可避免的會與RNA發生相互作用。下面我們一起來看看ＲＮＡ純化過程中會出現的4類問題以及相應的應對策略↓↓↓
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問題與策略
1
酚類物質的純化
Question
：
植物組織中果實部分以及樹木類植物中富含酚類化合物，其會隨著植物器官的增長而增加，此外針葉類植物中所含有的酚類化合物要比落葉植物的葉子中更多。植物組織經破碎處理後，釋放酚類物質，隨後酚類物質被氧化，氧化後的處理液逐漸變為褐色，並隨氧化程度的增加而加深，這一過程被稱為褐化效應，而酚氧化後形成的醌能與RNA結合，導致RNA活性喪失，而用苯酚、氯仿抽提時，RNA還會丟失或形成不溶性複合物，從而影響RNA的分離純化。
Answer
：
1。植物組織採集過程中應儘可能採集幼嫩組織，對組織進行冷凍儲存，並在短時間內提取RNA；對於採集回的樣品如要長期儲存，應經液氮處理後儲存在-80℃冰箱，且在樣品與裂解液接觸前，應防止冷凍的樣品解凍，否則酚易被氧化成醌。
2。為防止多酚氧化，在裂解樣品的同時可以加入適量的抗氧化劑。
PS：
β-巰基乙醇是個不錯的選擇，它可以抑制氧化反應；
Plant RNA isolation aid （Ambion， AM9690）也是個不錯的選擇。
Notice
：
如果植物是茶類、
紫荊類
，推薦一款不錯的試劑盒— RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根，DP441），這些都是妹紙在實驗中摸索出來的哦~
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多糖類物質的純化
Question
：
多糖作為植物細胞的結構組成和營養物質在植物細胞中大量存在，它是干擾植物RNA提取的主要因素，它的許多理化性質與RNA相似，因此很難將它們分離。另外多糖可與RNA結合形成膠狀物質，這不但影響實驗的操作，而且可以透過引起酶的活性中心改變或必需基團的改變而抑制酶的活性，嚴重影響分子生物學實驗的後續工作。（莫慌，你都看到這裡了，小編自然不會虧待你，策略在下面哦~↓↓↓）
Answer
：
1。在常規的提取方法中，透過鹽酸胍處理可以去除部分多糖；在高濃度Na+或K+存在條件下，透過苯酚、氯仿也可以除去一些多糖；此外還可以透過LiCl沉澱RNA，將部分多糖保留在上清液中，
但該法易丟失miRNA
。但即使透過這些方法仍會有相當大一部分多糖與RNA纏繞在一起難以分離，所以需要更有效的解決方案。
PS：
如果組織樣品屬於澱粉含量較高的植物樣品，如馬鈴薯、甘薯的塊莖、香蕉等，推薦：RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根，DP441），如果是蘋果、桃子、櫻桃、番茄等普通的多糖類植物，推薦使用：TRK-1001（LC-bio）。
3
蛋白質純化
Question
：
RNase和多酚氧化酶都屬於蛋白質，要想獲得高質量、完整的RNA，必須對有蛋白質汙染的樣品RNA進行純化操作。
Answer
：
1。裂解液中加入蛋白質變性劑，如異硫氰酸胍，2-巰基乙醇，SDS等可去除大部分蛋白質。
2。可以利用蛋白酶K降解蛋白質，最後再用苯酚/氯仿除去殘留的蛋白質或是直接利用TRK-1002試劑盒對RNA進行後續的純化工作。
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次級代謝產物的純化
次生代謝產物是指某些生物利用某些初生代謝產物為原料，在一系列酶的催化下，形成一些特殊的化學物質，這些化學物質即為次生代謝產物，這是一類非生長所必需的小分子有機化合物，但對於植物自身在複雜環境中的生存和發展起著不可替代的作用，如生物鹼、黃酮類、萜類、有機酸、木質素等。
Question
：
許多高等植物尤其是成熟組織能產生某些水溶性的次級代謝產物，這些產物很容易與RNA結合並被共同抽提出來，進而阻礙RNA的分離。
PS
：
因不確定這些代謝產物具體是什麼物質，目前還沒有特別好的方案來解決這一問題，不過大家可以嘗試使用選擇性沉澱來純化。
妹紙的經驗就分享到這了，對於植物RNA提取，你是不是更有信心了呢？！如果你也有更好的小技巧，歡迎與我們分享，我們也可以將你的經驗分享給更多的小夥伴，大家互相幫助，一起進步~你覺得如何？
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