「文獻解讀」GhADF6介導的肌動蛋白重組與棉花對黃萎病菌的抗病性

題目：

GhADF6-mediated actin reorganization is associated with defence against Verticillium dahliae infection in cotton

期刊名：Molecular Plant Pathology

作者：Yongduo Sun， Haiyun Wang

單位：中科院微生物所

小編寄語：一篇典型的透過基因沉默和轉基因植株驗證基因功能的文章。

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背景

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已有的研究表明，肌動蛋白解聚因子 （ADF） 參與植物抗病反應。然而，功能機制似乎錯綜複雜，需要進一步探索。在這項研究中，研究者在陸地棉中發現了一個ADF6基因（稱為GhADF6），該基因明顯參與了棉花對真菌病原體黃萎病菌的反應。GhADF6 與肌動蛋白絲結合並在體外和體內具有肌動蛋白解聚活性。當棉花根部（真菌入侵部位）接種病原菌後，表皮細胞中GhADF6的表達明顯下調。透過病毒誘導的基因沉默（VIGS）實驗，GhADF6的下調錶達增強了棉花對V。 dahliae的耐受性。

技術路線

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主要結果

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3。1 陸地棉對V。 dahliae響應的ADF基因鑑定

為了確定哪些ADF對V。 dahliae有反應，在V。 dahliae接種後的不同時間點對根中具有高組成型表達的 20 個ADF的轉錄水平進行了量化（圖 1a）。這些基因的表達模式是多樣的。其中，GH_A09G0773/GH_D09G0714表現特別。其基因表達在接種後 6 小時後顯著降低，並且在測試的時間範圍內持續下調（圖 1a）。轉錄表達的逐漸下降表明GH_A09G0773/GH_D09G0714可能持續負責棉花的防禦反應。基於系統發育分析，GH_A09G0773/GH_D09G0714與擬南芥ADF6的關係最密切（圖 1b）。因此，GH_A09G0773/GH_D09G0714 被命名為 GhADF6。

3。2 GhADF6 蛋白在植物細胞中與 F-actin 共定位

GhADF6 蛋白在體內的亞細胞分佈結果顯示。增強型綠色熒光蛋白 （eGFP） 標記的 GhADF6 （GhADF6-eGFP） 透過農桿菌侵染本氏菸草的表皮細胞中與特徵良好的肌動蛋白報告基因 fABD2-mCherry 共表達。以遊離 eGFP 和 fABD2-mCherry 的共表達作為對照，使用共聚焦顯微鏡觀察融合蛋白的瞬時表達。如圖所示，GhADF6-eGFP 融合蛋白（非遊離 eGFP），表現出與fABD2-mCherry的熒光模式相匹配的分佈模式，證明GhADF6 定位於 F-肌動蛋白。同時，還在細胞核中觀察到 GhADF6-eGFP。

3。3 GhADF6沉默的棉花植株對V。 dahliae的耐受性更強

為了研究GhADF6下調對V。 dahliae感染的生理意義，首先透過TRV誘導的基因沉默 （VIGS） 技術建立了GhADF6表達量降低的陸地棉植物。在農桿菌介導的 VIGS 浸潤兩週後，白化病表型出現在棉葉上，從而證實了我們的實驗條件下的 VIGS 效率。沉默GhADF6 ，對應於GhADF6 mRNA 3‘非翻譯區 （UTR） 的 243-bp 片段的序列被克隆到 VIGS 載體中，然後將含有該構建體的農桿菌細胞浸潤到棉花子葉中。兩週後，從頂部葉子中提取總RNA，以透過RT-qPCR驗證沉默能力。如圖5b所示，與對照相比，GhADF6 沉默的幼苗中的GhADF6 mRNA 水平下降了約 80% 。

隨後，將GhADF6沉默的和對照的棉花植株接種V。 dahliae，並分析和比較疾病相關症狀。儘管對照植物的葉子在接種後 20 天（dpi）出現黃色並嚴重枯萎，但GhADF6沉默植物的症狀似乎明顯較弱（圖 5a）。GhADF6沉默的植物的疾病指數（DI）顯著低於對照（圖 5c）。這些結果表明，GhADF6的下調可以對棉花植物的抗病性產生積極影響。

3。4 GhADF6的下調增加了棉花根表皮細胞肌動蛋白絲的比例

研究者觀察到棉花根部中的肌動蛋白絲和肌動蛋白束對黃萎病菌的反應都有所增加。為了觀察GhADF6沉默的棉花植物與野生型植物相比的肌動蛋白結構變化，檢測了根表皮細胞中的肌動蛋白絲。對在水培條件下生長的棉花植物的根進行顯微鏡觀察。與對照相比，GhADF6沉默的植物根中肌動蛋白絲的丰度和肌動蛋白束的程度均顯著增加（圖6a）。在GhADF6沉默的植物中，肌動蛋白絲的百分比高於對照植物（圖 6b，c）。

結論

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研究者的結果表明：植物需要增加絲狀肌動蛋白（F-肌動蛋白）丰度和透過動態肌動蛋白重塑從而

防禦

病原體

入侵

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