擴增子裡妥妥的C位是它，你想到了嗎？

所謂擴增子，簡單地理解，就是經過人工擴增的DNA片段或RNA片段的擴增產物。擴增子測序主要包括16S rDNA測序、18S rDNA測序、ITS測序及目標區域擴增子測序等。今天要向大家介紹的是擴增子裡的C位——OTU君。你想到了嗎，C位就是OUT君，為什麼要把OTU君擺在C位呢，是名副其實還是名不副實？且聽美格基因一一道來。

一、OTU聚類

OTU，即operational taxonomic units，是微生物學研究中最常見的術語之一，為了方便研究樣品的物種組成多樣性資訊，需對樣品的有效序列進行聚類，在預設給定的相似度（預設97%）下將clean tags聚類成OTUs，得到每個cluster的序列，並分別隨機賦予一個編號（OTU ID）。

二、singleton OTU及嵌合體去除

通常認為高通量測序獲得的singleton OTU（只有一條代表序列的 OTU），是由於測序錯誤造成的，或者是來自於PCR過程中產生的嵌合體，因此聚類的同時usearch會根據UCHIME演算法將singleton OTU及嵌合體去除，得到最終的Effective Tags。

注：Effective（%）為Effective Tags佔Clean Tags的百分比。

三、挑選OTU代表性序列

為了下游分析可以有效地進行，利用Qiime從每個OTU的序列中抽取一條代表序列，用於統計每個OTU的序列數和物種註釋。挑選代表序列的方法包括三種：選取出現頻數最高的序列、選取最長的序列以及隨機選取，預設採用第一種方法。

四、建立otu_table_raw

利用usearch統計singleton OTU和嵌合體去除後每個OTU的序列數，生成原始序列分佈情況表otu_table_raw。

注：第一列為過濾singleton OTU和嵌合體後的OTU編號，其餘各列代表各個OTU在不同樣品中的序列數。

五、回爐深造

1、OTU是什麼？

OTU（operational taxonomic units），即操作分類單元。透過一定的距離度量方法計算兩兩不同序列之間的距離度量或相似性，繼而設定特定的分類閾值，獲得同一閾值下的距離矩陣，進行聚類操作，形成不同的分類單元。

2、OTU在16S測序中有何用？

高通量測序得到的16S序列有成千上萬條，如果對每條序列都進行物種註釋的話，工作量大、耗時長，而且16S擴增、測序等過程中出現的錯誤會降低結果的準確性。在16S分析中引入OTU，首先對相似性序列進行聚類，分成數量較少的分類單元，基於分類單元進行物種註釋。這不僅簡化工作量，提高分析效率，而且OTU在聚類過程中會去除一些測序錯誤的序列，提高分析的準確性。

3、OTU如何聚類？

OTU聚類的方法多種多樣，如Uclust、cd-hit、BLAST、mothur、usearch和 prefix/suffix，這些聚類方法均可以在QIIME軟體中實施。不同聚類方法基於不同的演算法，得到的聚類結果雖然不同，但是大體的聚類流程都是一致的。

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