真菌的DNA和RNA提取方法

一、真菌DNA的提取（方法一）

1。實驗試劑

（1）DNA提取液：0。2M Tris-HCl（pH 7。5），0。5M NaCl，0。01M EDTA，1％SDS

（2）3M NaAc

（3）TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8。0，1 mmol/L EDTA

（4）酚（pH8。0）：氯仿：異戊醇（25：24：1）

（5）氯仿：異戊醇（24：1）

（6）異丙醇

（7）無水乙醇

（8）75%乙醇

（9）RNaseA

2。實驗步驟

（1）取真菌菌絲0。5g， 在液氮中迅速研磨成粉

（2）加入4mL提取液，快速振盪混勻

（3）加入等體積的4mL的氯仿：異戊醇（24：1），渦旋3～5min（此處是粗提沒有加酚，可以節約成本）

（4）1000rpm，4℃，5min

（5）上清用氯仿：異戊醇（24：1）再抽提一次（10，000rpm，4℃離心5min）

（6）取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇或2。5倍體積的無水乙醇沉澱， 混勻， 靜置約30 min

（7）用毛細玻棒挑出絮狀沉澱，用75%乙醇反覆漂洗數次，再用無水乙醇漂洗1次，吹乾，重懸於500ul TE中

（8）加入1ul RNaseA （10mg/mL），37℃處理1h

（9）用酚（pH8。0）：氯仿：異戊醇（25：24：1）和氯仿：異戊醇（24：1）各抽提1次（10，000rpm，4℃離心5min）

（10）取上清，1/10V 3M NaAc，2。5V體積的無水乙醇，-70℃沉澱30min以上

（11）沉澱用75%乙醇漂洗，風乾，溶於200ul TE中，-20℃儲存備用

二、真菌DNA的提取（方法二）

1。真菌菌絲0。5-1g，在液氮中迅速研磨成粉

2。加入3mL 65℃預熱的DNA提取緩衝液，快速振盪混勻65℃水浴30min，期間混勻2-3次

3。加入1mL 5M KAc，冰浴20min

4。氯仿：異戊醇（24：1）抽提1次（10，000rpm，4℃離心5min）

5。取上清，加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇，混勻，靜置約30 min

6。用毛細玻棒挑出絮狀沉澱，用75%乙醇反覆漂洗數次，再用無水乙醇漂洗1次，吹乾，重懸於500ul TE中

7。加入1ul RNaseA（10mg/mL），37℃處理1h

8。用酚（pH8。0）：氯仿：異戊醇（25：24：1）和氯仿：異戊醇（24：1）各抽提1次（10，000rpm，4℃離心5min）

9。取上清，1/10V 3M NaAc，2。5V體積的無水乙醇，-70℃沉澱30min以上

10。沉澱用75%乙醇漂洗，風乾，溶於200ul TE中，-20℃儲存備用

DNA提取緩衝液：100mM Tris-HCl（pH8。0），20mM EDTA（pH8。0），1。5M NaCl，2% CTAB（W/V），4% PVP40（W/V）和2%巰基乙醇（V/V），PVP和巰基乙醇使用前加入5M KAc

方法一和二，是大同小異。主要是DNA提取液配方不一樣！成本也不一樣！

三、真菌菌絲的總RNA的提取

1。實驗試劑

（1）RNA提取緩衝液（CTAB）：2% CTAB（W/V），2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP（W/V），100mM Tris-HCl（pH8。0，DEPC處理的水配置），25mM EDTA，0。5g/L 亞精胺Spermidine，2。0M NaCl，2%巰基乙醇（V/V，使用前加入）。由於在高溫滅菌條件下，Tris-HCl要和DEPC發生反應，所以配RNA提取緩衝液時直接用DEPC 處理的水配製即可

（2）SSTE：1 M NaCl，0。5% SDS（W/V），10mM Tris-HCl pH8。0，1。0mM EDTA

（3）10M LiCl 直接用蒸餾水配10M LiCl，加1‰的DEPC過夜後，高溫滅菌

（4）3M NaAc

（5）氯仿：異戊醇（24：1）

（6）酚（pH4。5）：氯仿：異戊醇（25：24：1）

（7）DEPC處理水 用1‰的DEPC處理蒸餾水過夜，高溫滅菌

（8）無水乙醇；70%酒精

2。實驗步驟

（1）實驗開始前將RNA提取液於65℃水浴鍋中預熱，離心管中加入ME（巰基乙醇），（10mL加80ul，50mL中加入300ul）

（2）取約0。8g菌絲體（液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可！固體培養就更好說了），在液氮中迅速磨成精細粉末，裝入50mL離心管，按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液，顛倒混勻

（3）65℃水浴3-10 min，期間混勻2-3次

（4）加入等體積的酚（注意是酸酚pH4。5）：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提（10，000rpm，4℃，5 min）

（5）取上清，等體積的氯仿：異戊醇（24：1）抽提（10，000rpm，4℃，5 min）

（6）加入1/4V體積10M LiCl溶液，4℃放置6h以上（或過夜）

（7）10，000rpm，4℃離心20min

（8）棄上清，用500ul SSTE溶解沉澱

（9）酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）抽提兩次，氯仿：異戊醇（24：1）抽提1次（10，000rpm，4℃，5min）

（10）加2V體積的無水乙醇，在-70℃冰箱沉澱30min以上

（11）12，000rpm，4℃離心20 min

（12）棄上清。沉澱用70%酒精漂洗一次，乾燥

（13）加200ul的DEPC處理水溶解

（14）用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量

（在抽提過程中，若蛋白質含量或其它的雜質還較多，可以增加抽提次數）

注意：提取RNA請儘量在低溫下操作，如果條件不容許，在室溫下操作的時間要儘可能的短。