《鼠年說鼠》第十期：如何提取組織DNA模板？

《鼠年說鼠》系列文章，每週二更新，專門解答大小鼠鏟屎官們在養鼠過程中經常遇到的繁育與鑑定類的問題，同時向大家徵集問題，任何基因編輯鼠飼養繁殖或鑑定的困惑統統可以丟給小賽，小賽會給您回覆或統一在後面的內容為大家做出詳細的解答。今天我們開始進入鑑定篇～

鑑定基因編輯鼠剪爪、剪尾組織量是多少？

根據實驗經驗，剪爪、剪尾應在出生後 7—12 天內完成，這樣一方面既可避免母鼠吃仔，另一方面該時段的大小鼠容易抓取、出血較少，提取的基因組質量較高。

1。鼠尾尾尖（<5mm）可獲得足夠量DNA用於基因型鑑定。

2。AAALAC要求斷趾法，最好用於小於7日齡的新生鼠，斷趾操作剪取的鼠爪量為鼠爪趾尖組織1-2mm。

如何提取組織DNA模板？

方法一:

使用 TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction kit （Ver。5。0_Code No。 9765） 來提取鼠尾基因組DNA。

準備工作：

1。備好無水乙醇。

2。WB使用前需要加入65mL的無水乙醇（試劑盒推薦56mL，我們經過長期資料顯示，加入65mL提取的基因組純度更高）。

3。Buffer GL若出現沉澱，請於56℃加熱溶解，待恢復至室溫後使用。

4。洗脫膜上的DNA時，用0。25X TE buffer洗脫的DNA儲存時間更持久；使用前放置56℃預熱，DNA洗脫效率更高。

實驗流程：

1。每個裝有樣品的EP管中加 180μL Buffer GL， 20μL 蛋白酶K（用試劑盒裡的蛋白酶K加20μL 即可，該濃度是20mg/mL），10μL RNA酶。（注意：鼠尾不能太長，一般2~5mm；如果鼠尾實在過粗，可以增大裂解體系至300μL）。

2。放置56℃ 烘箱過夜反應（一般12~16個小時）。

3。第二天早上從烘箱取出樣品放置離心機裡，12000rpm離心2分鐘，將毛髮雜質離到管底。

4。吸取上清至另一干淨的EP管中（注意儘量不要吸到管底的毛髮和雜質），再加入200μL Buffer GB 和 200μL的無水乙醇，蓋好蓋子後上下顛倒混勻。

5。混勻後將液體轉移至準備好的吸附柱中，12000rpm離心2分鐘；棄濾液。

6。向吸附柱中加入500μL Buffer WA，12000rpm離心1分鐘；棄濾液。

7。吸附柱的管壁四周加入700μL Buffer WB ，靜置1分鐘，再12000rpm離心1分鐘；棄濾液；（注意：一定要保證WB中已經加過了指定體積的無水乙醇；沿著吸附柱管壁四周加入WB，有助於完全沖洗沾附管壁上的鹽份。）

8。重複操作步驟7，棄濾液。

9。空甩： 12000rpm 離心2分鐘。

10。將吸附柱放置在一個新的1。5mL的離心管上，蓋子開著，室溫放置10分鐘，以去除殘留的乙醇；（注意：乙醇殘留會抑制聚合酶擴增）。

11。向吸附柱膜的中央加入50μL 預熱過的0。25X TE buffer，蓋好蓋子後室溫靜置10分鐘；（注意：預熱的滅菌水可以提高洗脫效率）。

12。12000rpm 離心2分鐘洗脫DNA；可以將離下的液體再次加入膜中央，再靜置5分鐘，再12000rpm 離心2分鐘，獲得濃度更高的DNA。

13。將獲得DNA測濃度，也可以透過電泳觀察純度。

方法二:

使用粗裂的方法獲得鼠尾基因組DNA（適用於擴增＜1kb的條帶）。

Triton裂解液的配製：（1L量）

1）分別用電子天平稱取下列物品至燒杯：

KCl：3。7g

Tris：1。2g

2）加入300~400mL滅菌水溶解。

3）加入1mL TritonX-100，充分溶解，若不能充分溶解可以放入56℃烘箱中溶解。（TritonX-100呈油狀液體，注意吸取前先潤洗移液器，注意打盡TritonX-100後才能把槍頭伸到溶液中反覆吹吸，否則很容易使得TritonX-100大量殘留在槍頭內壁上）。

4）加入80μL濃鹽酸調pH至9。0。

5）然後用滅菌水定容至1L後，室溫儲存，待用。

注意：TritonX-100高壓滅菌後會產生大量沉澱，請勿高壓滅菌。

樣品的裂解：

1）取鼠尾或者鼠爪（~2mm）至EP管，加入98μL裂解液+2μL 20mg/mL的蛋白酶K（注：鼠尾不可超過3mm，不然裂解不充分，若鼠尾過粗，可以適量增加裂解液的量；蛋白酶K需要注意不要反覆凍融，不然會影響活性）。

2）加了裂解液和蛋白酶K後，將EP管放入56℃烘箱或者水浴鍋，過夜執行；

第二天從烘箱中取出樣品，放置金屬浴或者PCR儀中，98℃反應15分鐘，目的是使蛋白酶K失活。

3）之後將樣品離心15分鐘，上清即可作為PCR模板。（一般25μL的PCR體系中，可以加入1。5μL的上清）。

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