《分子生物學實驗》複習資料

儲存率和活細胞率有什麼關係

1、什麼是質粒？質粒的基本性質有哪些？

①質粒是染色體外能夠進行自主複製的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中染色體以外的脫氧核糖核酸（DNA）分子。現在習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質粒常被用作基因的載體。

②具有複製起點；攜帶易於篩選的選擇標記；具有多種限制性內切酶的切割位點；具有較小的相對分子質量和較高的複製數。

2、

質粒抽提實驗中溶液I、

II

、

II

I各有什麼作用？

①溶液I：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl組成（保護、緩衝）。

葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，減少抽提過程中的機械剪下作用，防止破壞質粒（保護作用）。

EDTA的作用是絡合掉鎂等二價金屬離子，防止DNA酶對質粒分子的降解作用（保護作用）。

Tris-HCl使溶菌液維持溶菌作用的最適PH範圍（緩衝作用）。

②溶液II：由SDS（十二烷基硫酸鈉）與NaOH組成（裂解、變性）。

SDS的作用是解聚核蛋白並與蛋白質分子結合使之變性（裂解細胞和蛋白質變性作用）。

NaOH（PH>12）的作用是破壞氫鍵，使DNA分子變性（DNA變性作用）。

③溶液III：HAc和KAc組成的高鹽溶液（復性，分離）。

HAc溶液能中和溶液Ⅱ的鹼性，使染色體DNA變性而發生纏繞，並使質粒DNA復性。

KAc會與SDS形成溶解度很低的鹽，並與蛋白質形成沉澱而除去；溶液中的DNA也會與蛋白質-SDS複合物纏繞成大分子而與小分子質粒DNA分離。

3、

在質粒提起實驗中，用溶液

III

處理後，要進行離心分離。此時，質粒DNA分子在（上清液，沉澱物）中，細菌基因組DNA分子在（上清液，沉澱物）中。

上清液；沉澱物。

4、鹼裂解法抽提質粒DNA的基本原理是什麼？

鹼裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA之間在拓撲學上的差異而達 到分離目的。PH 介於12。0~12。5時，線性DNA變性，雙鏈開啟，而質粒DNA雖變性，但兩條互補鏈彼此纏繞，當PH恢復到中性時，質粒DNA可迅速準確的完成復性，而線性DNA復性較困難，纏繞成網狀，透過離心可沉澱除去。

5、在鹼裂解法提取質粒DNA操作中應注意哪些問題？

（1）正確使用移液器。

（2）溶液ll必須新鮮配製。

（3）加入酚-氯仿後必須充分混勻。

（4）混勻的過程不能太過劇烈。

（5）每次棄上清液時都應用移液器吸去管壁上黏附的水珠。

（6）吸取酚-氯仿溶液時要將Tip頭插入液體分層的下側。

6、在鹼裂解法提取質粒DNA時，酚/氯仿的作用是什麼？

酚是強烈的蛋白質變性劑，能有效使蛋白質變性而除去，氯仿有強烈的脂溶

性，去除脂類雜質，本身酚：氯仿：異戊醇=25：24：1的主要作用是抽提蛋白質。

7

、在質粒提起實驗的最後兩步，要加入2倍體積的乙醇和70%的乙醇溶液。這裡不同濃度乙醇的作用是什麼？

無水乙醇的為了是沉澱DNA繼而達到濃縮DNA的目的，70％的乙醇是為了洗滌DNA，進一步除去雜質。

8、提取植物基因組DNA的基本原理是什麼？在操作過程中應該注意什麼？

①基本原理：利用液氮對植物組織進行研磨，從而破碎細胞。細胞提取液中含 有的 SDS 溶解膜蛋白而破壞細胞膜，使蛋白質變性而沉澱下來。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的 DNA 溶液經異丙醇沉澱。

②注意事項：

⑴材料要新鮮嬌嫩，葉片研磨地越細越好；

⑵操作應為無菌操作；

⑶操作應溫和，不宜劇烈晃動；

⑷注意移液器的正確使用。

9、在植物基因組提取過程中，DNA降解的可能原因？

⑴從植物中提取 DNA 時沒對細胞內的DNA酶進行滅活；

⑵操作過程中被細菌汙染了；

⑶口水等含酶物質飛入樣品中；

⑷溫度、PH等變化過於劇烈。

10、在植物基因組提取過程中，提高DNA產量的措施？

應當選取幼嫩的葉片，因為幼嫩葉片中的DNA含量高些；組織抽提前要儲存 在液氮中，以免DNA被破壞；純化時注意抑制核酸酶汙染，使用EDTA等防止DNA降解；整個實驗過程應該溫和操作，不能劇烈振盪，混合過程要輕緩，減少抽提，減少DNA片段被認為降解，因為過度振盪會使DNA斷裂成小片段。

11、在使用苯酚進行DNA提取時應該注意什麼？

酚一定要進行鹼平衡，苯酚具有高度腐蝕性，飛濺到面板、粘膜、眼睛會對人體造成損傷，應當注意防護；它是出去蛋白質的，要充分振盪使蛋白質變性，但不能太劇烈而打斷DNA；離心後應該避免再次吸入有機相的苯酚—氯仿，儘量只取上清，不應該讓苯酚最後仍有殘留，需抽提幹淨。

12、在提取植物基因組DNA過程中，使用苯酚與氯仿的作用是什麼？

用苯酚和氯仿抽取，去除多餘的蛋白，保證提取的基因組較純淨。

13、在植物基因組提取過程中，該如何檢測和保證基因組DNA的質量？

檢測：瓊脂糖凝膠電泳；保證DNA活性：用EDTA抑制DNA酶活性，從而保證DNA不被破壞。

14、鹼裂解法提取的質粒DNA分子一般有幾種構

象

？電泳時移動速率有何差異？

共價閉環DNA>線狀DNA>開環DNA

15、用瓊脂糖凝膠分離DNA的理論依據是什麼？

DNA 分子在高於其等電點的溶液中帶負電，在電場中向正極移動。由於糖磷酸骨架在結構上的重複性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的淨電荷，因此它們能以相同的速率向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決於分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。

16、為何在對凝膠進行操作時要帶一次性手套？

瓊脂糖凝膠電泳時戴一次性手套能夠有效阻止EB的滲入。EB是強誘變劑並有中等毒性，配製和使用時都應戴手套。

17、DNA 分子在電泳緩衝液中帶正電荷還是負電荷？它在電場中的移動方向如何？電泳中你觀察到哪些現象？

DNA帶負電荷，在電場中向正極移動

18、影響瓊脂糖凝膠DNA遷移速率的因素有哪些？分別有何種影響？

①電壓越大速率越大。②DNA 分子量越小速率越大。③DNA 的分子結構：超 螺旋最快，線型次之，開環最慢。④介質的種類和濃度。⑤EB ⑥電泳緩衝液

19、若有60 kb～100 kb大小的系列DN

A片

段要進行分離鑑定，應採取哪種型別的電泳方法才能進行有效分離？為什麼？

恆定電場強度下的瓊脂糖凝電泳。糖凝膠可以製成不同大小的孔隙度，具有分子篩的效應，所以恆定場的瓊脂糖凝膠電泳適於分離60kb-100kb的DNA片段，DNA片段的遷移率和分子的大小和高階結構有密切關係。

PCR儀

20、簡述PCR反應的原理。

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）：是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，又稱無細胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴增技術。它不僅可用於基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可用於疾病的診斷。

PCR基本原理類似於DNA的體內複製。在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在條件下依賴於DNA聚合酶的酶促合成反應。

PCR技術是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。它的特異性是由兩個人工合成的引物序列決定。引物就是與待擴增DNA片段兩側互補的寡核苷酸。雙鏈DNA是在臨近沸點的溫度下加熱時便會分離成兩條單鏈DNA分子（變性），兩引物分別與兩條DNA的兩側序列特異復性，在適宜條件下，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，利用反應混合物中的4種脫氧核苷三磷酸，在引物的引導下，按5‘→3’方向複製互補DNA，即引物的延伸。在適宜的條件下，這種熱變性→復性→延伸的過程不斷迴圈重複，前一個迴圈的產物DNA可作為後一個迴圈的模板DNA參與DNA合成，使產物DNA的量按2n方式擴增。

21、PCR一般體系應加入哪些試劑？

模板

引物

TaqDNA聚合酶

4種dNTP混合物

Mg2+

10×緩衝液

22、PCR防止

其它

DNA汙染，應注意哪些問題？

標本放置時密封要嚴避免溢於容器外，容器要清潔避免造成相互間交叉汙染； 移液器使用要規範避免汙標本間汙染；無菌工作臺操作，避免氣體中有雜菌。

23、影響PCR產物產量的因素主要有哪些？

引物、酶的種類及濃度、dNTP 的質量（優劣）與濃度、模板核酸的量與純 化程度、Mg2+濃度、溫度與時間、迴圈次數。

24、引物設計應注意哪些問題？

（1）引物長度不宜過長20bp左右較佳；

（2）引物擴增片段的長度以200-500為宜；

（3）引物鹼基的中G+C的含量應在40-60%為宜，G+C太少則擴增效果不佳，G+C 過多則 易出現非特異條帶；

（4）避免引物內部出現二級結構，避免兩天引物間互補，特別是3‘端的互補否則會形成二聚體結構；

（5）引物3’端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致PCR失敗。

25、簡述克隆某一原核生物基因片段一般操作步驟？

克 隆某一原核生物基因片段是可用PCR技術對基因進行大量擴增，首先準備好實驗材料大體為：需擴增的模板DNA、DNA聚合酶、dNTP混合液、PCR緩衝液、引物等、其過程大體分為3個步驟：

第一步：變性：透過加熱使 DNA 模板雙螺旋鏈解離為單鏈，

第二步：退火：當溫度突然降低時。由於模板DNA結構複雜難再互補，而引物建構簡單且數量巨多易於模板 DNA 互補雜交從而使引物結合到 模板上DNA上，

第三步：延伸：在DNA聚合酶和四種底物及鎂離子存在條件下DNA連開始延伸。以上3個步驟為一個迴圈，數小時後即可得到大量擴增的目的片段。

26、什麼是限制性內切酶？

限制性內切酶是一類能夠識別雙鏈 DNA 分子中的某種特定核苷酸序列，並由 此切割 DNA 雙鏈結構的核酸內切酶，有三種類型，Ⅰ類，Ⅱ類，Ⅲ類，他們都 有甲基化修飾功能和限制酶功能，Ⅱ類常用於分子克隆

27、常見的Ⅱ型限制性內切酶切割雙鏈DNA後會產生 末端或 末端。

粘性，平

28、下列有關限制性內切酶的描述，錯誤的是：（C）

A．一種限制性內切酶只能識別一種特定的脫氧核苷酸序列

B．限制性內切酶的活性受溫度的影響

C．限制性內切酶能識別和切割RNA

D．限制性內切酶可以從原核中提取

29、現有一長度為1000bp的DNA分子，用限制性核酸內切酶EcoR I酶切後得到的DNA分子仍是1000bp，用KpnI單獨酶切得到400 bp和600bp2種長度的DNA分子．用EcoR I，Kpn l同時酶切後得到200bp和600bp2種長度的DNA分子。請畫出該DNA可能的酶切圖譜。

30、一個限制性內切酶的識別序列和切割位點是5ˊ一G↓GATCC一3ˊ，在質粒上有該酶的一個切點，請畫出質粒被該限制性內切酶切割後所形成的黏性末端。

——G GATCC——寫在上面，

——CCTAG G——寫在下面。

該酶為限制性內切酶I。

31、基因工程中，切割目的基因和載體所用的限制酶及切口必備的特點是

（

A

）

A．可用不同的限制性內切酶，露出的黏性末端必須相同

B．必須用相同的限制性內切酶，露出的黏性末端可不相同

C．必須用相同的限制性內切酶，露出的黏性末端必須相同

D．可用不同的限制性內切酶，露出不同的黏性末端

32、在遺傳工程技術中，限制性內切酶主要用於（D）

A。目的基因的提取和匯入

B。目的基因的匯入和檢測

C。目的基因與運載體結合和匯入

D。目的基因的提取和與運載體結合

33、在分子生物學實驗中，常使用微量移液器，請說明在使用微量移液器時需要注意什麼？

1。 確定合適的量程，不可超過量程取液。

2。 取液時按到第一檔，Tip頭垂直進入液麵3-5毫米取液。移液器注意不能接觸溶液。

3。 打出液體時貼壁並有一定角度，要按到第二檔將液體全部壓出。

4。 使用完畢後，打下tip頭，放好移液器。

34、現有量程為0.1-2.5ul；1-10ul；2.5-20ul；10-200ul；100-1000ul的移液器各一支，請問，當吸取0.15ul，0.5ul，5ul，15ul，100ul，750ul液體時，各需要選取哪種最佳量程範圍的移液器？

分別是0。1-2。5 ，0。1-2。5 ，1-10，2。5-20，10-200，100-1000。

移液器

35、本學期我們學習了CaCl2法制備大腸桿菌感受態細胞和熱休克法轉化質粒DNA，你還知道哪些方法可以製備大腸桿菌感受態細胞和轉化的方法？

甘油—聚乙二醇法，一步法，山梨醇、CaCl2、RbCl等化學試劑法。

36

、在質粒DNA轉化大腸桿菌時，是如何進行篩選的？

因為質粒pETBlue-2帶有青黴素抗性基因，所以轉化成功的大腸桿菌細胞能在含羧苄青黴素的瓊脂糖平板上生長形成菌落。所以用含羧苄青黴素的瓊脂糖平板可以篩選出轉化成功的大腸桿菌。

37

、藍白班篩選的原理是什麼？

一些載體（如PUC系列質粒）帶有β-半乳糖苷酶（lacZ）N端α片段的編碼區，該編碼區中含有多克隆位點（MCS），可用於構建重組子。這種載體適用於僅編碼β-半乳糖苷酶C端ω片段的突變宿主細胞。因此，宿主和質粒編碼的片段雖都沒有半乳糖苷酶活性，但它們同時存在時，α片段與ω片段可透過α-互補形成具有酶活性的β-半乳糖苷酶。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落。而當外源DNA插入到質粒的多克隆位點後，幾乎不可避免地破壞α片段的編碼，使得帶有重組質粒的LacZ-細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，稱為藍白斑篩選。

38

、在質粒DNA轉化大腸桿菌感受態細胞時，如果將用來浸泡玻璃棒的酒精引燃起火該如何處理？

用水打溼的毛巾，著火時用毛巾蓋上就行了

39

、衛星菌落出現的原因是什麼？該如何避免？

（1）衛星菌落是氨苄降解後生長的雜菌。可能是感受態細胞的問題也可能是轉化過程出現操作失誤例如未在冰中進行轉化，感受態在常溫下放置過久失活，轉化後搖菌時間過短，或者搖床速度過慢，沒有把菌搖起來，如果不是轉化過程出現的問題就要進一步考慮連線是否正確，連線時間12~16h，體系一般6ul-10ul，目的片段：載體一般1：3~1：10。

（2）可以將培養時間控制在12h-16h 之 間 ，或者更換抗生素為羧苄青黴素

40、

影響所制

備感

受態效率的因素有哪些？

（1）大腸桿菌生長狀態

（2）氯化鈣濃度

（3）冰上放置時間

（4）儲存溫度

41

、轉化後為什麼要溫育1小時，為什麼加入的是無抗培養基？

（1）溫育就是讓感受態恢復一下狀態，以及一些相關抗性基因的表達。畢竟從-70℃環境中取出，需一段時間適應才可轉化。

（2）因為細胞比較脆弱，加無抗培養基是為了讓細胞生長，促使在轉化過程中獲得的新表型得到表達。

42

、如果實驗中對照組本不該長出菌落的平板上長出了一些菌落，你將如何解釋這種現象？

（1）操作過程儀器、器皿等不是無菌的，出現了一些雜菌和雜DNA的汙染

（2）細菌在感受態時發生了一些自然變異，對所加的抗生素有一定的抗性，所以長出一些菌落

（3）所加的抑菌抗生素濃度不夠，不能夠抑制住細菌的生長

（4）一些實驗誤差，錯將菌液放錯

43

、在轉化實驗中，實驗組和對照平皿應有什麼樣的結果？如何解釋這個結果？

實驗組中長出菌落而對照組中無任何菌落生長

44、

在學習製備感受態細胞時，為什麼要保證細胞密度

<

10

8

/ml？甘油的作用是什麼？

細胞生長密度以剛進入對數生長期時為宜，密度過高或不足均會影響轉化效率，一次要保證細胞密度<108/ml。

甘油的目的是防止水在凍結過程中產生過大的冰晶損傷細胞，抑制大腸桿菌生長，以便儲存。

45、

透過分子生物學實驗，你認為自己掌握了哪些實驗技能？你對分子生物學實驗有哪些建議與意見？